Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Bileşimi fizyolojik hücre dışı ortama veya sitoplazmaya uyan bir banyo çözeltisine örnek içeren bir kayıt odasını mikroskop aşamasına yerleştirerek başlayın.. Elektrolit çözeltisinde yıkanmış gümüş bir elektrot içeren, hücre içi koşulları taklit eden bir pipet olan kayıt mikropipetini pozitif basınç uygulayarak nörona doğru ilerletin ve hücre zarı ile temas edin.
Membran ve pipet arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için pozitiften negatif basınca hafifçe geçin. Hücreyi sabit bir voltajda tutmak için amplifikatör üzerinde bir tutma potansiyeli ayarlayın. Ardından emme uygulayarak mikropipetteki hücre zarını yırtın.
Hücre zarı yırtıldıktan sonra, tutma potansiyeli voltaj kapılı iyon kanallarından iyon akışına neden olur ve bir membran potansiyeli oluşturur, kayıt elektrodu tarafından kaydedilen. Hemen membran potansiyelini kaydedin. Kayıt elektrodu sinyali geri besleme amplifikatörüne iletir, bu da membran potansiyelini tutma potansiyelinden çıkarır-- membran potansiyelinin görsel bir görüntüsünü sunan bir osiloskop ve bir bilgisayar. Aşağıdaki protokolde, bir zebra balığı embriyosundaki Mauthner hücresinde bir yama kelepçesi ölçümü yapacağız.
- Yama sıkıştırmaya hazırlanmak için, ince duvarlı borosilikat camlı bazı yama kelepçe pipetlerini yatay bir çekme aracına çekerek başlayın. Pipet ucu çapları, ateş parlatıldıktan sonra pürüzsüz bir kenara yaklaşık 0,2 ila 0,4 mikrometredir ve şaft konik yaklaşık 4 milimetre uzunluğundadır.
Ucu hücre içi sıvıya batırarak pipet ucunu hücre içi çözelti ile doldurun. Daha sonra pipete bir şırınga iğnesi yerleştirin ve pipeti doldurmayı bitirmek için hücre içi çözeltiyi şırıngadan hafifçe dışarı atın. Pipetleri elektrofizyoloji kurulumundaki amplifikatör baş aşamasına takın. Baş sahneyi yatay eksene yaklaşık 45 derecelik bir açıyla tutmak önemlidir, çünkü bu, Mauthner hücresi ile yüksek dirençli contaların oluşumuna uygun pipet için bir giriş açısı sağlar.
Pipet banyo çözeltisine inmeden hemen önce, uç engelleme şansını azaltmak için pipete az miktarda pozitif basınç uygulayın. Pipette az miktarda pozitif basınçla M hücresine yaklaşmaya devam edin. Pozitif basınç hücreyi hafifçe bir yandan diğer yana itir ve hücrenin üzerine hemen konumlandırıldığında hücre zarında küçük bir gamze oluşturur.
Şimdi, pipet ve membran arasında güçlü bir sızdırmazlık oluşabilmesi için hücre yüzeyini hafifçe temizlemek için pipeti birkaç saniye yerinde bırakın. Sonra contayı başlatmak için pipetteki pozitif basıncı serbest bırakın.
Daha sonra, amplifikatördeki tutma potansiyelini eksi 60 milivolt olarak değiştirin. Hücre zarını bir dizi kısa emiş darbesiyle yırtın. Ardından hemen membran potansiyellerini kaydedin ve kapasitans yapıtlarını en aza indirin. Hücre kapasitansını ve erişim direncini% 70 ila% 85 oranında telafi edin.
Erişim direnci her 30 saniyede bir dakikaya kadar izlenmelidir ve %20 veya daha fazla bir değişiklik olursa, deneyi iptal edin. Deney sona erdikten ve yeterli veri elde edildikten sonra, arka beyinleri bir çift ön ayakla çıkararak embriyoyu feda edin.
