Visualisation et analyse de la taille des amibes des espèces d’Acanthamoeba

Pour commencer, placez les souches d’acanthamoeba sous un microscope à champ clair. Visualisez l’amibe à un grossissement de 4x où l’arrière-plan apparaît gris clair et l’amibe est sombre. Ajustez l’éclairage et la mise au point du microscope pour vous assurer que les amibes apparaissent comme des cernes solides.

Configurez ensuite le logiciel d’imagerie pour enregistrer à intervalles réguliers avec un intervalle maximal de 30 secondes entre les images pour un suivi précis. Suivez les amibes sur plusieurs jours, en enregistrant par segments d’une heure toutes les 12 heures pendant cinq jours. Si le microscope et le logiciel le permettent, utilisez les coordonnées XY pour enregistrer l’emplacement de plusieurs puits ou cellules d’écoulement en une seule session.

Si nécessaire, assemblez plusieurs sections à partir d’un seul puits ou d’une seule cellule d’écoulement pour une vue agrandie à un grossissement de 4x. Ouvrez le fichier du microscope dans le logiciel d’imagerie. La boîte de dialogue des options d’importation du format bio est maintenant visible.

Dans la boîte de dialogue, activez l’affichage de la pile, définissez l’affichage avec sur la sélection hyperstack. Cochez ensuite la case Utiliser la pile virtuelle dans la gestion de la mémoire et définissez le mode de couleur par défaut. Ouvrez maintenant les options de série de format bio et sélectionnez la série requise.

Appuyez ensuite sur OK. Accédez à l’image, puis sélectionnez Dupliquer pour dupliquer uniquement l’image d’un seul puits en choisissant uniquement un canal C et un canal Z. Travaillez exclusivement avec l’image dupliquée pour une manipulation ultérieure. Cliquez sur l’image suivie du type et de 8 bits pour convertir l’image.

Choisissez ensuite le processus suivi de soustraire l’arrière-plan. Réglez la balle roulante sur 10. Cochez l’option d’arrière-plan clair et sélectionnez paraboloïde coulissant.

Naviguez maintenant jusqu’à processus, suivi d’un contraste amélioré. Ajustez les paramètres de pixels saturés à 0,1 % pour les trophozoites individuels, ou à 0,3 % pour les groupes de cellules et d’agrégats. Cliquez séquentiellement sur l’image, ajustez et seuilz avec la valeur par défaut supérieure au noir et blanc.

Cela ouvrira les paramètres du processus binaire. Choisissez la valeur par défaut et vérifiez le fond noir des masques binaires. Ajustez le seuil de manière agressive pour minimiser le bruit de fond tout en vous assurant que chaque amibe est partiellement visible.

Si le logiciel a inversé les couleurs pour rendre l’arrière-plan blanc et l’amibe noir, allez dans Modifier et cliquez sur Inverser pour le passer à un fond noir avec une amibe blanche. Cliquez maintenant séquentiellement sur processus, suivi de binaire et fermer pour connecter de légers espaces dans la membrane externe des cellules. Remplissez tous les trous restants en cliquant sur traiter, binaire et remplir les trous.

Ensuite, utilisez l’outil de dessin de forme et appuyez sur modifier puis sur remplir pour supprimer tous les artefacts non amibiens. Si nécessaire, inversez à nouveau l’image pour finaliser la représentation binaire. Pour enregistrer la taille de chaque amibe, cliquez sur analyser, puis sur analyser les particules.

Réglez ensuite la taille sur 10-infini, la circularité entre zéro à un et le spectacle à zéro. Cochez l’option Afficher uniquement les résultats et résumer pour obtenir l’analyse sans visuels supplémentaires. Enregistrez le résultat dans des fichiers CSV, puis cliquez sur fichier, puis sur Enregistrer sous et TIFF pour enregistrer l’image au format TIFF.

Modifiez le nom selon vos besoins.