Visualisierung und Amöbengrößenanalyse von Akanthamöbenarten

Zu Beginn legen Sie die Stämme von Akanthamöben unter ein Hellfeldmikroskop. Visualisieren Sie die Amöbe bei 4-facher Vergrößerung, wobei der Hintergrund hellgrau und die Amöbe dunkel erscheint. Passen Sie die Beleuchtung und den Fokus des Mikroskops an, um sicherzustellen, dass die Amöben als durchgehende dunkle Ringe erscheinen.

Konfigurieren Sie dann die Bildgebungssoftware so, dass sie in regelmäßigen Abständen mit einem maximalen Abstand von 30 Sekunden zwischen den Bildern aufzeichnet, um eine genaue Verfolgung zu gewährleisten. Verfolgen Sie Amöben über mehrere Tage, indem Sie über einen Zeitraum von fünf Tagen alle 12 Stunden in Segmenten von einer Stunde aufzeichnen. Wenn das Mikroskop und die Software es zulassen, verwenden Sie die XY-Koordinaten, um mehrere Wells oder Durchflusszellenpositionen in einer einzigen Sitzung aufzuzeichnen.

Fügen Sie bei Bedarf mehrere Abschnitte aus einer einzigen Vertiefung oder Durchflusszelle zusammen, um eine erweiterte Ansicht bei 4-facher Vergrößerung zu erhalten. Öffnen Sie die Mikroskopdatei in der Bildgebungssoftware. Das Dialogfeld für die Importoptionen des Bioformats wird jetzt angezeigt.

Aktivieren Sie im Dialogfeld die Stapelanzeige, und setzen Sie die Ansicht auf Auswahl-Hyperstack. Aktivieren Sie dann unter Speicherverwaltung die Option Virtuellen Stack verwenden und setzen Sie den Farbmodus auf Standard. Öffnen Sie nun die Optionen für Bioformat-Serien und wählen Sie die gewünschte Serie aus.

Drücken Sie dann OK. Navigieren Sie zu Image und wählen Sie dann Duplizieren, um nur das Image eines einzelnen Wells zu duplizieren, indem Sie nur einen C-Kanal und einen Z-Kanal auswählen. Arbeiten Sie ausschließlich mit dem duplizierten Bild, um es weiter zu bearbeiten. Klicken Sie auf das Bild, gefolgt von Typ und 8 Bit, um das Bild zu konvertieren.

Wählen Sie dann Prozess gefolgt von Hintergrund subtrahieren. Stellen Sie die rollende Kugel auf 10. Aktivieren Sie die Option für den hellen Hintergrund und wählen Sie Gleitparaboloid.

Navigieren Sie nun zum Prozess, gefolgt von erweitertem Kontrast. Passen Sie die Einstellungen für gesättigte Pixel auf 0,1 % für einzelne Trophozoiten oder 0,3 % für Gruppen von Zellen und Aggregaten an. Klicken Sie nacheinander auf Bild, Anpassen und Schwellenwert, wobei der Standardwert größer als Schwarzweiß ist.

Dadurch werden die binären Prozesseinstellungen geöffnet. Wählen Sie die Standardeinstellung und aktivieren Sie den schwarzen Hintergrund der Binärmasken. Passen Sie den Schwellenwert aggressiv an, um Hintergrundgeräusche zu minimieren und gleichzeitig sicherzustellen, dass jede Amöbe teilweise sichtbar ist.

Wenn die Software die Farben invertiert hat, um den Hintergrund weiß und die Amöbe schwarz zu machen, gehen Sie zu Bearbeiten und klicken Sie auf Umkehren, um auf einen schwarzen Hintergrund mit weißer Amöbe umzuschalten. Klicken Sie nun nacheinander auf Prozess, gefolgt von binär und schließen, um kleine Lücken in der äußeren Membran der Zellen zu verbinden. Füllen Sie alle verbleibenden Löcher, indem Sie auf Verarbeiten, Binär und Löcher füllen klicken.

Verwenden Sie dann das Formzeichenwerkzeug und drücken Sie auf Bearbeiten gefolgt von Füllen, um alle Nicht-Amöbenartefakte zu entfernen. Falls erforderlich, invertieren Sie das Bild erneut, um die binäre Darstellung abzuschließen. Um die Größe jeder Amöbe aufzuzeichnen, klicken Sie auf Analysieren, gefolgt von Partikel analysieren.

Stellen Sie dann die Größe auf 10 unendlich, die Zirkularität zwischen null auf eins und die Show auf nichts ein. Aktivieren Sie die Option Nur Ergebnisse anzeigen und zusammenfassen, um die Analyse ohne zusätzliche Visualisierungen zu erhalten. Speichern Sie das Ergebnis in CSV-Dateien, klicken Sie dann auf Datei, gefolgt von Speichern unter und TIFF, um das Bild in einem TIFF-Format zu speichern.

Bearbeiten Sie den Namen nach Bedarf.