Visualização e análise do tamanho da ameba de espécies de Acanthamoeba

Para começar, coloque as cepas de acanthamoeba sob um microscópio de campo brilhante. Visualize a ameba com ampliação de 4x, onde o fundo aparece cinza claro e a ameba é escura. Ajuste a iluminação e o foco do microscópio para garantir que as amebas apareçam como olheiras sólidas.

Em seguida, configure o software de imagem para gravar em intervalos regulares com um intervalo máximo de 30 segundos entre as imagens para um rastreamento preciso. Rastreie amebas ao longo de vários dias, gravando em segmentos de uma hora a cada 12 horas durante cinco dias. Se o microscópio e o software permitirem, use as coordenadas XY para registrar vários poços ou localizações de células de fluxo em uma única sessão.

Se necessário, junte várias seções de um único poço ou célula de fluxo para uma visualização expandida com ampliação de 4x. Abra o microscópio file no software de imagem. A caixa de diálogo de opções de importação do formato bio agora é vista.

Na caixa de diálogo, habilite a exibição de pilha, defina a exibição com para a seleção hyperstack. Em seguida, marque usar pilha virtual no gerenciamento de memória e defina o modo de cor como padrão. Agora abra as opções de série de formato bio e selecione a série necessária.

Em seguida, pressione OK. Navegue até a imagem e selecione duplicar para duplicar apenas a imagem de um único poço, escolhendo apenas um canal C e um canal Z. Trabalhe exclusivamente com a imagem duplicada para manipulação posterior. Clique na imagem seguida do tipo e 8 bits para converter a imagem.

Em seguida, escolha o processo seguido de subtrair fundo. Defina a bola rolante para 10. Marque a opção de fundo claro e selecione o parabolóide deslizante.

Agora navegue até o processo seguido pelo contraste aprimorado. Ajuste as configurações de pixels saturados para 0,1% para trofozoítos individuais ou 0,3% para grupos de células e agregados. Clique sequencialmente na imagem, ajuste e limite com o padrão maior que preto e branco.

Isso abrirá as configurações do processo binário. Escolha o padrão e marque o fundo preto das máscaras binárias. Ajuste o limite agressivamente para minimizar o ruído de fundo, garantindo que cada ameba esteja parcialmente visível.

Se o software inverteu as cores para tornar o fundo branco e a ameba preta, vá em editar e clique em inverter para mudar para um fundo preto com ameba branca. Agora clique sequencialmente no processo, seguido de binário e feche para conectar pequenas lacunas na membrana externa das células. Preencha os buracos restantes clicando em processar, binário e preencher buracos.

Em seguida, use a ferramenta de desenho de forma e pressione editar seguido de preenchimento para remover quaisquer artefatos que não sejam ameba. Se necessário, inverta a imagem novamente para finalizar a representação binária. Para registrar o tamanho de cada ameba, clique em analisar, seguido de analisar partículas.

Em seguida, defina o tamanho para 10-infinito, a circularidade entre zero para um e o show para nada. Marque a opção de exibir apenas resultados e resumir para obter a análise sem visuais adicionais. Salve o resultado em arquivos CSV e clique em arquivo, seguido de salvar como e TIFF para salvar a imagem em um formato TIFF.

Edite o nome conforme necessário.