Visualización y análisis del tamaño de las amebas de las especies de Acanthamoeba

Para comenzar, coloque las cepas de acanthamoeba bajo un microscopio de campo brillante. Visualice la ameba con un aumento de 4x, donde el fondo aparece de color gris claro y la ameba es oscura. Ajusta la iluminación y el enfoque del microscopio para asegurarte de que las amebas parezcan como círculos oscuros sólidos.

A continuación, configure el software de imágenes para que grabe a intervalos regulares con un intervalo máximo de 30 segundos entre imágenes para un seguimiento preciso. Realice un seguimiento de las amebas durante varios días, grabando en segmentos de una hora por cada 12 horas durante cinco días. Si el microscopio y el software lo permiten, utilice las coordenadas XY para registrar varios pozos o ubicaciones de celdas de flujo en una sola sesión.

Si es necesario, cose varias secciones de un solo pocillo o celda de flujo para obtener una vista ampliada con un aumento de 4x. Abra el archivo del microscopio en el software de imágenes. Ahora se ve el cuadro de diálogo de opciones de importación del formato bio.

Dentro del cuadro de diálogo, habilite la visualización de pilas, establezca la vista con la selección hyperstack. A continuación, marque usar pila virtual en Administración de memoria y establezca el modo de color en predeterminado. Ahora abra las opciones de la serie de formato bio y seleccione la serie requerida.

A continuación, pulse OK. Vaya a la imagen y, a continuación, seleccione duplicar para duplicar solo la imagen de un solo pozo eligiendo solo un canal C y un canal Z. Trabaje exclusivamente con la imagen duplicada para su posterior manipulación. Haga clic en la imagen seguida de tipo y 8 bits para convertir la imagen.

A continuación, elija el proceso seguido de restar el fondo. Coloque la bola rodante en 10. Marque la opción de fondo claro y seleccione el paraboloide deslizante.

Ahora navegue hasta el proceso seguido de un contraste mejorado. Ajuste la configuración de píxeles saturados al 0,1 % para trofozoítos individuales, o al 0,3 % para grupos de células y agregados. Haga clic secuencialmente en la imagen, ajuste y umbral con un valor predeterminado mayor que blanco y negro.

Esto abrirá la configuración del proceso binario. Elija el valor predeterminado y verifique el fondo negro de las máscaras binarias. Ajuste el umbral de manera agresiva para minimizar el ruido de fondo y asegurarse de que cada ameba sea parcialmente visible.

Si el software invirtió los colores para hacer que el fondo sea blanco y la ameba negra, vaya a editar y haga clic en invertir para cambiarlo a un fondo negro con ameba blanca. Ahora haga clic secuencialmente en el proceso, seguido de binario y cerca para conectar ligeros espacios en la membrana externa de las células. Rellene los agujeros restantes haciendo clic en procesar, binario y rellenar huecos.

A continuación, utiliza la herramienta de dibujo de formas y pulsa editar seguido de rellenar para eliminar cualquier artefacto que no sea de ameba. Si es necesario, invierta la imagen de nuevo para finalizar la representación binaria. Para registrar el tamaño de cada ameba, haga clic en analizar, seguido de analizar partículas.

A continuación, establece el tamaño en 10-infinito, la circularidad entre cero a uno y el espectáculo a nada. Marque la opción solo mostrar resultados y resumir para obtener el análisis sin objetos visuales adicionales. Guarde el resultado en archivos CSV, luego haga clic en archivo, seguido de guardar como y TIFF para guardar la imagen en formato TIFF.

Edite el nombre según sea necesario.