Transducción para etiquetar células tumorales PDX: Introducción de Lentivirus que expresa marcador fluorescente en la célula tumoral in vitro

Lentivirus es un Retrovirus que contiene material genético de ARN. Este virus proporciona un método eficiente y estable para introducir transgenes en las líneas celulares del cáncer. Comience añadiendo neuraminidasa a un tubo que contiene Lentivirus que expresa proteína fluorescente verde, o GFP. Mantenga el tubo a 37 grados Centígrados durante una hora para aumentar la eficiencia de unión del virus.

A continuación, centrífuga un tubo que contiene suspensión de células tumorales para formar un pellet. Agregue medios de mamosfera que contengan polibreno para resuspend las células. La polibreno es un polímero catiónico que aumenta la eficiencia de la infección lentiviral. Ahora platea el número óptimo de células tumorales por pozo en una placa de cultivo de seis tejidos de pozo. Agregue la cantidad requerida de Lentivirus en cada pozo de la placa de cultivo.

Arremolina la placa para mezclar el contenido, y mantener a 37 grados Celsius durante 96 horas con un suministro continuo de dióxido de carbono. El Lentivirus entra en la célula y libera ARN. La transcriptasa inversa viral convierte el ARN en ADN doblemente varado que se integra en el genoma del huésped. Coloque la placa bajo un microscopio fluorescente y supervise las células para una transducción exitosa. Las células transducidas fluoresce debido a la expresión GFP.

En el protocolo de ejemplo, realizaremos la transducción de células tumorales disociadas por PDX con vectores lentivirales.

Para transducir las células tumorales, centrífuga las células aisladas para su resuspensión en dos mililitros de la mamosfera media. Después de contar, centrífuga las células de nuevo y resuspend el pellet en dos mililitros de medio mamosfera, complementado con 20 microlitros de polibreno. A continuación, placa 2 por 10 a la quinta células tumorales viables por pozo en una placa de cultivo de tejido de seis pozos de adherencia ultra baja y partículas lentivirales a las células en una multiplicidad de infección de 10.

Arremolina la placa para mezclar el virus con las células e incubar los co-cultivos a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante un máximo de 96 horas, añadiendo 500 microlitros de medios frescos de mamosfera después de las primeras 24 horas. Cuando al menos el 10% de las células sean GFP positivas, transfiera las células transducidas de al menos un pozo a un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo y lave el pozo con un mililitro de medio mamosfera.

Junta el lavado con las células y centrífuga las células tumorales en 10 mililitros de HBSS más HEPES. Finalmente, resuspend las células en 50 microlitros de extracto de matriz de sótano en hielo y cargar las células incrustadas en una jeringa de insulina de 0,5 mililitros para la reimplantación.