Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Cancer Research

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Monstervoorbereiding voor metabolomics

 
Click here for the English version

Monstervoorbereiding voor metabolomics: een methode om celmonsters voor te bereiden op metabolietprofilering

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Metabolomics is de studie om metabolieten in de cellen te identificeren en te kwantificeren. Om het monster voor te bereiden, begint u met het zaaien van borstkankercellen samen met groeimedium in twee platen die zijn gelabeld als test en controle. Incubeer drie dagen bij 37 graden Celsius. Verwijder nu het medium en voeg vers medium met estradiol toe aan de testplaat en gewoon medium in de bedieningsplaat.

De estradiol bindt aan oestrogeen receptor alfa in borstkankercellen om bepaalde expressies te induceren, waardoor een verandering in de samenstelling van de metaboliet. Incubeer de platen voor de gewenste duur. Vervang het medium door ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS om de cellen te wassen en voeg vervolgens ijskoud aceton toe. De ijskoude reagentia stoppen de werking van proteasen en voorkomen zo eiwitafbraak.

Gebruik nu een schraper om de cellen van de platen los te maken en breng ze met behulp van een pipet over naar buizen. Neem 20 microliters van deze celsuspensie op een hemocytometer en tel het aantal cellen. Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot ze worden gebruikt voor verdere analyse. In het volgende protocol bereiden we monsters van MCF-7 cellen voor gaschromatografie en massaspectrometrie.

Voeg met behulp van MCF-7 cellen gekweekt volgens het tekstprotocol vijf milliliter ijskoude 1x PBS toe aan de plaat. Kantel vervolgens de plaat meerdere keren voordat u de PBS verwijdert. Herhaal dit nog twee keer en verwijder zoveel mogelijk PBS na de laatste wasbeurt. Voeg 750 microliter voorgekookte aceton toe aan elke plaat en schraap de cellen en combineer de cellen van twee platen tot een buis van twee milliliter op ijs.

Om de cellen voor normalisatie te tellen, gebruikt u voor elke behandeling twee extra platen voor celkwantificering. Voeg vervolgens 2 milliliter HE-buffer toe en incubeer gedurende vijf minuten om de cellen van de platen los te maken. Meng de cellen grondig door de HE-buffer in te pipetten.

Gebruik vervolgens 20 microliters van de celoplossing in een hemocytometer om het celnummer onder een microscoop te tellen. Bewaar de monsters bij negatieve 80 graden Celsius voordat u gaschromatografie massaspectrometrieanalyse gebruikt om de metabolieten te identificeren en te kwantificeren. Uitvoeren van integratieve analyse volgens het tekstprotocol.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter