Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Cancer Research

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Beispielvorbereitung für Metabolomik

 
Click here for the English version

Beispielvorbereitung für Metabolomik: Eine Methode zur Vorbereitung von Zellproben für metabolitische Profilierung

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Metabolomics ist die Studie zur Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten in den Zellen. Um die Probe vorzubereiten, beginnen Sie mit der Aussaat von Brustkrebszellen zusammen mit Wachstumsmedium in zwei Platten, die als Test und Kontrolle gekennzeichnet sind. Drei Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nun das Medium und fügen Sie frisches Medium mit Estradiol in die Prüfplatte und einfaches Medium in die Steuerplatte ein.

Das Östradiol bindet an Östrogenrezeptor Alpha in Brustkrebszellen, um bestimmte Ausdrücke zu induzieren, was zu einer Veränderung der Metabolitzusammensetzung führt. Inkubieren Sie die Platten für die gewünschte Dauer. Ersetzen Sie das Medium durch eiskalte Phosphat gepufferte Saline oder PBS, um die Zellen zu waschen und dann eiskaltes Aceton hinzuzufügen. Die eiskalten Reagenzien stoppen die Wirkung von Proteasen und verhindern so den Proteinabbau.

Verwenden Sie nun einen Schaber, um die Zellen von den Platten zu lösen und sie mit Hilfe einer Pipette in Rohre zu übertragen. Nehmen Sie 20 Mikroliter dieser Zellsuspension auf ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der Zellen. Bewahren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie für die weitere Analyse verwendet werden. Im folgenden Protokoll bereiten wir Proben aus MCF-7-Zellen für die Gaschromatographie und Massenspektrometrie vor.

Mit MCF-7-Zellen, die gemäß dem Textprotokoll kultiviert werden, fügen Sie der Platte fünf Milliliter eiskalte 1x PBS hinzu. Dann kippen Sie die Platte mehrmals, bevor Sie die PBS entfernen. Wiederholen Sie zwei weitere Male entfernen so viel PBS wie möglich nach der letzten Wäsche. Fügen Sie 750 Mikroliter vorgekühltem Aceton zu jeder Platte hinzu und kratzen Sie die Zellen, dann kombinieren Sie die Zellen aus zwei Platten zu einem Zwei-Milliliter-Rohr auf Eis.

Um die Zellen für die Normalisierung zu zählen, verwenden Sie für jede Behandlung zwei zusätzliche Platten für die Zellquantifizierung. Dann, um die Zellen von den Platten zu lösen fügen 2 Milliliter HE Puffer und inkubieren für fünf Minuten. Mischen Sie die Zellen gründlich, indem Sie im HE-Puffer Pipettieren.

Verwenden Sie dann 20 Mikroliter der Zelllösung in einem Hämozytometer, um die Zellzahl unter dem Mikroskop zu zählen. Bewahren Sie die Proben bei negativen 80 Grad Celsius auf, bevor Sie die Gaschromatographie-Massenspektrometrieanalyse verwenden, um die Metaboliten zu identifizieren und zu quantifizieren. Führen Sie eine integrative Analyse gemäß dem Textprotokoll durch.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter