Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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मेटाबोलोमिक्स कोशिकाओं के भीतर मौजूद मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए अध्ययन है। नमूना तैयार करने के लिए, परीक्षण और नियंत्रण के रूप में लेबल दो प्लेटों में विकास माध्यम के साथ स्तन कैंसर कोशिकाओं बोने से शुरू करते हैं । तीन दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर। अब मीडियम को हटा दें और कंट्रोल प्लेट में टेस्ट प्लेट और प्लेन मीडियम में एस्ट्राडियोल के साथ फ्रेश मीडियम डालें।
एस्ट्रोडिओल स्तन कैंसर कोशिकाओं में एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा को बांधकर कुछ अभिव्यक्तियों को प्रेरित करता है, जिससे मेटाबोलाइट संरचना में बदलाव जाता है। वांछित अवधि के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को धोने के लिए बर्फ कोल्ड फॉस्फेट बफर खारा या पीबीएस के साथ माध्यम की जगह और फिर बर्फ ठंडा एसीटोन जोड़ें । बर्फ ठंड अभिकर् प प्रोटेस की कार्रवाई को रोकता है और इस प्रकार प्रोटीन क्षरण को रोकता है।
अब प्लेटों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक स्क्रैपर का उपयोग करें, और उन्हें एक पिपेट की मदद से ट्यूबों में स्थानांतरित करें। इस सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोलीटर को हीमोसाइटोमीटर पर लें और कोशिकाओं की संख्या गिनें। नमूनों को आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम गैस क्रोमेटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एमसीएफ-7 कोशिकाओं से नमूने तैयार करते हैं।
पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार सुसंस्कृत एमसीएफ-7 कोशिकाओं का उपयोग करना, प्लेट में बर्फ ठंड 1x पीबीएस के पांच मिलीलीटर जोड़ें । इसके बाद पीबीएस निकालने से पहले प्लेट को कई बार झुकाएं। पिछले धोने के बाद जितना संभव हो उतना पीबीएस को हटाने के लिए दो और बार दोहराएं। प्रत्येक प्लेट में प्रीचिल्ड एसीटोन के 750 माइक्रोलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को परिमार्जन करें, फिर कोशिकाओं को दो प्लेटों से बर्फ पर दो मिलीलीटर ट्यूब में मिलाएं।
सामान्यीकरण के लिए कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, प्रत्येक उपचार के लिए, सेल मात्राकरण के लिए दो अतिरिक्त प्लेटों का उपयोग करें। फिर प्लेटों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए वह बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से एचई बफर में पाइपिंग करके मिलाएं।
फिर एक माइक्रोस्कोप के नीचे सेल नंबर गिनने के लिए हीमोसाइटोमीटर में सेल सॉल्यूशन के 20 माइक्रोलीटर का इस्तेमाल करें। मेटाबोलाइट्स की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए गैस क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करने से पहले नमूनों को नकारात्मक ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार एकीकृत विश्लेषण करें।
