メタボロミクスのサンプル調製: 代謝物プロファイリング用の細胞サンプルを準備する方法

メタボロミクスは、細胞内に存在する代謝産物を同定し、定量化するための研究である。サンプルを調製するには、乳癌細胞と増殖培地を検査および対照としてラベル付けされた2つのプレートに播種することから始めます。摂氏37度で3日間インキュベートします。次に、培地を取り出し、テストプレートにエストラジオールとコントロールプレートにプレーン培地で新鮮な培地を追加します。

エストラジオールは、ある種の表現を誘導するために、乳癌細胞のエストロゲン受容体αに結合し、代謝産物組成物の変化を引き起こす。所望の期間、プレートをインキュベートします。培地を氷冷リン酸緩衝生理食塩水またはPBSに置き換え、細胞を洗浄し、氷の冷たいアセトンを加えます。氷冷試薬はプロテアーゼの作用を停止し、タンパク質分解を防止します。

今、プレートから細胞を取り外すためにスクレーパーを使用し、ピペットの助けを借りてチューブに転送します。この細胞懸濁液の20マイクロリットルをヘモサイトメーターに取り、細胞数を数えます。さらに分析するために使用されるまで、サンプルをマイナス80°Cで保存します。以下のプロトコルでは、MCF-7細胞からのガスクロマトグラフィーおよび質量分析用のサンプルを調製する。

テキストプロトコルに従って培養したMCF-7細胞を用いて、5ミリリットルの氷冷1xPBSをプレートに加える。その後、PBSを取り外す前にプレートを数回傾けます。最後の洗浄後にできるだけ多くのPBSを取り除いてさらに2回繰り返します。各プレートに750マイクロリットルのプレチルアセトンを加え、細胞を掻き取り、2つのプレートの細胞を氷上の2ミリリットルチューブに結合します。

正規化のために細胞を数えるために、各処理に対して、細胞定量のために2つの余分なプレートを使用する。その後、プレートから細胞を取り外し、HEバッファーの2ミリリットルを加え、5分間インキュベートする。HEバッファー内でピペット処理を行い、細胞を十分に混ぜ合わせます。

その後、20マイクロリットルの細胞溶液をヘモサイトメーターで使用し、顕微鏡下で細胞数を数えます。ガスクロマトグラフィー質量分析を使用して代謝物を特定し定量する前に、サンプルをマイナス80°Cで保存します。テキストプロトコルに従って統合的な分析を行います。