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Encyclopedia of Experiments: Cancer Research

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Preparación de muestras para metabolómica

 
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Preparación de muestras para metabolómica: un método para preparar muestras celulares para la elaboración de perfiles de metabolitos

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Metabolómica es el estudio para identificar y cuantificar metabolitos presentes dentro de las células. Para preparar la muestra, comience por sembrar células de cáncer de mama junto con el medio de crecimiento en dos placas etiquetadas como prueba y control. Incuba durante tres días a 37 grados centígrados. Ahora, retire el medio y agregue el medio fresco con estradiol en la placa de ensayo y el medio liso en la placa de control.

El estradiol se une al receptor de estrógeno alfa en las células de cáncer de mama para inducir ciertas expresiones, causando un cambio en la composición del metabolito. Incubar las placas durante la duración deseada. Reemplace el medio con solución salina o PBS en tambaleados de fosfato frío para lavar las células y luego agregue acetona helada fría. Los reactivos fríos detienen la acción de los proteasas y, por lo tanto, evitan la degradación de las proteínas.

Ahora usa un rascador para separar las células de las placas y transfiéralas a tubos con la ayuda de una pipeta. Tome 20 microlitros de esta suspensión celular en un hemocítómetro y cuente el número de células. Almacene las muestras a menos 80 grados Centígrados hasta que se utilicen para su análisis posterior. En el siguiente protocolo, preparamos muestras de células MCF-7 para cromatografía de gases y espectrometría de masas.

Usando células MCF-7 cultivadas de acuerdo con el protocolo de texto, agregue cinco mililitros de hielo frío 1x PBS a la placa. A continuación, incline la placa varias veces antes de quitar el PBS. Repita dos veces más quitando tanto PBS como sea posible después del último lavado. Agregue 750 microlitros de acetona prechilled a cada placa y raspe las células, luego combine las células de dos placas en un tubo de dos mililitros sobre hielo.

Para contar las células para la normalización, para cada tratamiento, utilice dos placas adicionales para la cuantificación celular. A continuación, para separar las células de las placas añadir 2 mililitros de amortiguador HE e incubar durante cinco minutos. Mezcle bien las celdas pipeteando en el búfer HE.

A continuación, utilice 20 microlitros de la solución celular en un hemociclomómetro para contar el número de célula bajo un microscopio. Almacene las muestras a 80 grados celsius negativos antes de usar el análisis de espectrometría de masas de cromatografía de gases para identificar y cuantificar los metabolitos. Realice análisis integrativos de acuerdo con el protocolo de texto.

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