Provberedning för metabolomik: En metod för att förbereda cellprover för metabolitprofilering

Metabolomik är studien för att identifiera och kvantifiera metaboliter som finns i cellerna. För att förbereda provet, börja med att så bröstcancerceller tillsammans med tillväxtmedium i två plattor märkta som test och kontroll. Inkubera i tre dagar vid 37 grader Celsius. Ta nu bort mediet och tillsätt färskt medium med estradiol i testplattan och vanligt medium i kontrollplattan.

Estradiol binder till östrogenreceptor alfa i bröstcancerceller för att inducera vissa uttryck, vilket orsakar en förändring i metabolitsammansättningen. Inkubera plattorna under önskad tid. Ersätt mediet med iskallt fosfatbuffrat saltlösning eller PBS för att tvätta cellerna och tillsätt sedan iskallt aceton. De iskalla reagenserna stoppar proteasernas verkan och förhindrar därmed proteinnedbrytning.

Använd nu en skrapa för att lossa cellerna från plattorna och överför dem till rör med hjälp av en pipett. Ta 20 mikroliter av denna cellupphängning på en hemocytometer och räkna antalet celler. Förvara proverna på minus 80 grader Celsius tills de används för vidare analys. I följande protokoll förbereder vi prover från MCF-7 celler för gaskromatografi och masspektrometri.

Använd MCF-7-celler odlade enligt textprotokollet, tillsätt fem milliliter iskallt 1x PBS till plattan. Luta sedan plattan flera gånger innan du tar bort PBS. Upprepa ytterligare två gånger om du tar bort så mycket PBS som möjligt efter den sista tvätten. Tillsätt 750 mikroliter förfört aceton till varje tallrik och skrapa cellerna och kombinera sedan cellerna från två plattor till ett två milliliterrör på is.

För att räkna cellerna för normalisering, för varje behandling, använd två extra plattor för cell kvantifiering. För att sedan lossa cellerna från plattorna tillsätt 2 milliliter HE-buffert och inkubera i fem minuter. Blanda cellerna noggrant genom pipetting i HE-bufferten.

Använd sedan 20 mikroliter av celllösningen i en hemocytometer för att räkna cellnumret under ett mikroskop. Förvara proverna vid negativa 80 grader Celsius innan du använder gaskromatografi masspektrometri analys för att identifiera och kvantifiera metaboliterna. Utför integrativ analys enligt textprotokollet.