Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
الميتابوميك هي الدراسة لتحديد وتحديد الأيض الموجودة داخل الخلايا. لإعداد العينة، ابدأ بزرع خلايا سرطان الثدي جنبا إلى جنب مع متوسط النمو في لوحتين وصفت بأنها اختبار والسيطرة. حضانة لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية. الآن، إزالة المتوسطة وإضافة متوسطة جديدة مع استراديول في لوحة الاختبار والمتوسطة عادي في لوحة التحكم.
يرتبط استراديول مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا في خلايا سرطان الثدي للحث على تعبيرات معينة, مما تسبب في تغيير في تكوين المستقلب. احتضان لوحات للمدة المطلوبة. استبدال المتوسط مع الجليد الباردة الفوسفات المخزنة المالحة أو برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا ومن ثم إضافة الأسيتون الجليد الباردة. الكواشف الباردة الجليد وقف عمل البروتياز وبالتالي منع تدهور البروتين.
الآن استخدام مكشطة لفصل الخلايا من لوحات، ونقلها إلى أنابيب بمساعدة ماصة. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية هذا إلى مقياس الدم واحسب عدد الخلايا. تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية حتى تستخدم لمزيد من التحليل. في البروتوكول التالي، نقوم بإعداد عينات من خلايا MCF-7 للكروماتوغرافيا الغازية وقياس الطيف الكتلي.
باستخدام خلايا MCF-7 المستزرعة وفقا لبروتوكول النص ، أضف خمسة ملليلترات من الجليد البارد 1x PBS إلى اللوحة. ثم إمالة لوحة عدة مرات قبل إزالة برنامج تلفزيوني. كرر مرتين أكثر إزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان بعد غسل الماضي. إضافة 750 ميكرولتر من الأسيتون prechilled إلى كل لوحة وكشط الخلايا، ثم الجمع بين الخلايا من لوحتين في أنبوب ملليلتر اثنين على الجليد.
لحساب الخلايا للتطبيع، لكل علاج، استخدم لوحتين إضافيتين للقياس الكمي للخلايا. ثم لفصل الخلايا من لوحات إضافة 2 ملليلتر من العازلة HE واحتضان لمدة خمس دقائق. خلط الخلايا جيدا عن طريق pipetting في المخزن المؤقت HE.
ثم استخدم 20 ميكرولتر من محلول الخلية في مقياس الدم لحساب عدد الخلايا تحت المجهر. تخزين العينات في السلبية 80 درجة مئوية قبل استخدام تحليل الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا الغاز لتحديد وتحديد الأيض. إجراء تحليل تكاملي وفقا لبروتوكول النص.
