Prøveforberedelse til metabolomics: En metode til at forberede celleprøver til metabolitprofilering

Metabolomics er undersøgelsen til at identificere og kvantificere metabolitter til stede i cellerne. For at forberede prøven, begynde med såning brystkræftceller sammen med vækstmedium i to plader mærket som test og kontrol. Inkuber i tre dage ved 37 grader Celsius. Fjern nu mediet og tilsæt frisk medium med østradiol i testpladen og almindeligt medium i kontrolpladen.

Østradiol binder sig til østrogen receptor alpha i brystkræftceller til at fremkalde visse udtryk, forårsager en ændring i metabolit sammensætning. Inkuber pladerne i den ønskede varighed. Udskift mediet med iskold fosfat buffered saltvand eller PBS til at vaske cellerne og derefter tilføje iskold acetone. De iskolde reagenser stopper proteasernes virkning og forhindrer dermed proteinforringelse.

Brug nu en skraber til at løsne cellerne fra pladerne og overføre dem til rør ved hjælp af en pipette. Tag 20 mikroliter af denne celle suspension på en hæmocytometer og tælle antallet af celler. Prøverne opbevares ved minus 80 grader Celsius, indtil de bruges til yderligere analyse. I den følgende protokol forbereder vi prøver fra MCF-7 celler til gaskromatografi og massespektrometri.

Brug MCF-7 celler dyrket i henhold til tekstprotokollen, tilsæt fem milliliter iskold 1x PBS til pladen. Vip derefter pladen flere gange, før PBS fjernes. Gentag to gange mere at fjerne så meget PBS som muligt efter den sidste vask. Tilsæt 750 mikroliter prechilled acetone til hver plade og skrab cellerne, og kombiner derefter cellerne fra to plader i et to milliliter rør på is.

Hvis du vil tælle cellerne til normalisering, skal du bruge to ekstra plader til cellekvantificering for hver behandling. Derefter til at løsne cellerne fra pladerne tilføje 2 milliliter HE buffer og inkubere i fem minutter. Bland cellerne grundigt ved at pipette i HE-bufferen.

Brug derefter 20 mikroliter af celleopløsningen i et hæmocytometer for at tælle cellenummeret under et mikroskop. Prøverne opbevares ved negative 80 grader Celsius, før der foretages analyse af gaskromatografimassespektrometri til at identificere og kvantificere metabolitterne. Udfør integrativ analyse i henhold til tekstprotokollen.