Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Métabolomique est l’étude pour identifier et quantifier les métabolites présents dans les cellules. Pour préparer l’échantillon, commencez par ensemencer les cellules cancéreuses du sein ainsi que le milieu de croissance dans deux plaques étiquetées comme test et contrôle. Incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Maintenant, retirez le milieu et ajoutez le milieu frais avec l’estradiol dans la plaque d’essai et le milieu plat dans la plaque de commande.
L’estradiol se lie à l’alpha récepteur d’oestrogène dans les cellules cancéreuses de sein pour induire certaines expressions, causant un changement dans la composition de métabolite. Incuber les plaques pour la durée désirée. Remplacer le milieu par de la saline tamponnée de phosphate glacé ou PBS pour laver les cellules, puis ajouter de l’acétone glacé. Les réattributions glacées arrêtent l’action des protéases et empêchent ainsi la dégradation des protéines.
Maintenant, utilisez un grattoir pour détacher les cellules des plaques, et les transférer dans des tubes à l’aide d’une pipette. Prenez 20 microlitres de cette suspension cellulaire sur un hémocytomètre et comptez le nombre de cellules. Conserver les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour une analyse plus approfondie. Dans le protocole suivant, nous préparons des échantillons des cellules MCF-7 pour la chromatographie gazeuse et la spectrométrie de masse.
À l’aide de cellules MCF-7 cultivés selon le protocole textuel, ajouter cinq millilitres de 1x PBS glacé à la plaque. Inclinez ensuite la plaque plusieurs fois avant de retirer le PBS. Répétez deux fois de plus en enlevant autant de PBS que possible après le dernier lavage. Ajouter 750 microlitres d’acétone prétchilled à chaque plaque et gratter les cellules, puis mélanger les cellules de deux plaques dans un tube de deux millilitres sur la glace.
Pour compter les cellules pour la normalisation, pour chaque traitement, utilisez deux plaques supplémentaires pour la quantification cellulaire. Ensuite, pour détacher les cellules des plaques ajouter 2 millilitres de tampon HE et incuber pendant cinq minutes. Bien mélanger les cellules en pipetting dans le tampon HE.
Ensuite, utilisez 20 microlitres de la solution cellulaire dans un hémocytomètre pour compter le numéro de cellule au microscope. Stockez les échantillons à 80 degrés Celsius négatifs avant d’utiliser l’analyse de spectrométrie de masse de chromatographie gazeuse pour identifier et quantifier les métabolites. Effectuer une analyse intégrative selon le protocole du texte.
