Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Metabolomics er studien for å identifisere og kvantifisere metabolitter som finnes i cellene. For å forberede prøven, begynn med å så brystkreftceller sammen med vekstmedium i to plater merket som test og kontroll. Inkuber i tre dager ved 37 grader Celsius. Fjern nå mediet og tilsett friskt medium med østradiol i testplaten og vanlig medium i kontrollplaten.
Østradiolen binder seg til østrogenreseptor alfa i brystkreftceller for å indusere visse uttrykk, forårsaker en endring i metabolittsammensetningen. Inkuber platene for ønsket varighet. Bytt ut mediet med iskald fosfatbufret saltvann eller PBS for å vaske cellene og tilsett deretter iskald aceton. De iskalde reagensene stopper virkningen av proteaser og forhindrer dermed proteinforringelse.
Bruk nå en skrape for å løsne cellene fra platene, og overfør dem til rør ved hjelp av en pipette. Ta 20 mikroliter av denne cellefjæringen på et hemocytometer og tell antall celler. Oppbevar prøvene ved minus 80 grader Celsius til de brukes til videre analyse. I følgende protokoll forbereder vi prøver fra MCF-7 celler for gasskromatografi og massespektrometri.
Bruk MCF-7 celler dyrket i henhold til tekstprotokollen, legg fem milliliter iskald 1x PBS til platen. Vipp deretter platen flere ganger før du fjerner PBS. Gjenta to ganger til ved å fjerne så mye PBS som mulig etter siste vask. Tilsett 750 mikroliter prechilled aceton til hver plate og skrap cellene, og kombiner deretter cellene fra to plater i et to milliliterrør på is.
For å telle cellene for normalisering, bruk for hver behandling to ekstra plater for celle kvantifisering. Deretter legger du til 2 milliliter HE-buffer og inkuberer i fem minutter for å løsne cellene fra platene. Bland cellene grundig ved å pipettere i HE-bufferen.
Bruk deretter 20 mikroliter av celleløsningen i et hemocytometer for å telle cellenummeret under et mikroskop. Oppbevar prøvene ved negative 80 grader Celsius før du bruker gasskromatografi massespektrometrianalyse for å identifisere og kvantifisere metabolittene. Utfør integrativ analyse i henhold til tekstprotokollen.
