الهدف العام من هذا الإجراء هو استعراض تقنية التثبيت بالتروية التي نتبعها، والتي تركز على استخدام الضغوط الفسيولوجية للحفاظ بشكل صحيح على أنسجة دماغ الجرذ من أجل إجراءات الكيمياء النسيجية المناعية. أولاً، يتم توضيح كيفية استخدام وإعداد جهاز التروية. بعد ذلك، يتم تجميع الأدوات اللازمة لإجراء كل من جراحة التروية واستخراج الدماغ، ثم يوضع الحيوان المخدر تخديراً عميقاً في صينية ضحلة مملوءة بالثلج المجروش.
يتم إجراء شق جانبي بطول خمسة إلى ستة سنتيمترات عبر الجلد وجدار البطن أسفل القفص الصدري مباشرةً. يتم الكشف عن القلب ومن ثم إجراء عملية تروية للحيوان. وتتمثل الخطوة النهائية في إزالة الدماغ ووضعه في قارورة تحتوي على سائل تثبيت يعادل حجمه عشرة أضعاف حجم الدماغ على الأقل.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح تقنية التثبيت بالتروية الخاصة بنا، والتي تركز على استخدام الضغوط الفسيولوجية للحفاظ على أنسجة دماغ الجرذ بشكل صحيح من أجل الكيمياء النسيجية المناعية. سنبدأ بتجهيز جهاز التروية، وسيستغرق ذلك حوالي 10 دقائق. باستخدام حقنة سعة 50 ملليلتر، قم بغسل وتطهير خط المثبت بشكل متكرر باستخدام المنظم حتى يتم إزالة جميع فقاعات الهواء.
من الضروري لضمان نجاح عملية التروية عدم وجود فقاعات هوائية في أي من الخطوط. ويتم تحقيق ذلك عن طريق وضع صمام المخرج في دورق يحتوي على المحلول المنظم. الآن، أغلق صمام المخرج.
بعد ذلك، قم بإزالة الأنبوب من السرنجة مع الضغط عليها بحيث تتدلى قطرة من المحلول المنظم من الطرف. ضع الأنبوب المملوء، عند مدخل المادة المثبتة، في زجاجة تحتوي على 200 milliliters من مثبت البارالدهيد لكل حيوان، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء.
أحكم إغلاق الغطاء، مع التأكد من استقرار السدادة في موضعها بشكل صحيح. فإذا لم تكن السدادة مستقرة تماماً، لن يتم الحفاظ على الضغط داخل النظام المغلق. ضع الزجاجة في جهاز التروية.
قم بضبط التدفق من خط المنظم (buffer) فقط عن طريق إغلاق منفذ المخرج وتدوير صمام المنظم إلى نفس وضع صمام المثبت. افتح منفذ المخرج وقم بتفريغ خط المنظم كما تم القيام به سابقاً مع خط المثبت. وبمجرد تفريغ الخط، ضع الأنبوب في زجاجة المنظم.
بعد ذلك، اختبر قدرة النظام على تحمل الضغط. عند ضخ كرة المانومتر المطاطية، ستشعر بوجود مقاومة. وكتجهيز نهائي.
املأ إبرة التروية بالمحلول المنظم لمنع دخول الهواء. النظام الآن جاهز لعملية التروية. بعد إعطاء خليط الكيتامين والزيلازين مع التحقق من الوصول إلى مستوى التخدير الجراحي عبر طريقة قرص إصبع القدم، ضع الجرذ المخدر تماماً في صينية ضحلة مملوءة بالثلج المجروش.
لا تستمر في الإجراء ما لم يكن الحيوان تحت التخدير الكامل. ابدأ الجراحة بعمل شق جانبي بطول خمسة إلى ستة سنتيمترات عبر الجلد وجدار البطن أسفل القفص الصدري مباشرةً. افصل الكبد عن الحجاب الحاجز بعناية.
أحدث شقاً صغيراً في الحجاب الحاجز باستخدام المقصات غير الحادة المنحنية. يمكن لوضع إصبعك والضغط الممارس أن يساعدا في القدرة على قص الحجاب الحاجز. استمر في شق الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري بالكامل للكشف عن التجويف الجنبي.
ضع مقصات كليلة منحنية على أحد جانبي الأضلاع، مع إزاحة الرئتين بحذر، ثم قم بإجراء قطع عبر القفص الصدري وصولاً إلى عظمة الترقوة. بعد ذلك، قم بإجراء قطع مماثل على الجانب المقابل. الآن، ارفع عظمة القص بعيداً وقم بتقليم أي أنسجة متصلة بالقلب بعناية.
ثبّت طرف عظمة القص باستخدام الملقط الشرياني (hemostat) وضع الملقط فوق الرأس. يجب أن يرتفع الصدر إلى الأعلى مما يتيح رؤية واضحة للأوعية الدموية الرئيسية. وباستخدام مقصات القزحية (iris scissors)، قم بإجراء شق صغير في الطرف الخلفي للبطين الأيسر.
مرّر إبرة تروية ذات طرف غير مدبب أو طرف زيتوني بقياس 15 gauge من خلال البطين المقطوع إلى الأبهر الصاعد. يجب أن يكون طرف الإبرة مرئياً من خلال جدار الأبهر، ويجب ألا يصل إلى قوس الأبهر حيث تتفرع الشرايين العضدية والسباتية. لتثبيت الإبرة ومنع التسرب، قم بضم القلب باستخدام ملقط 혈vاستئصال (hemostat).
أخيرًا، استخدم مقص القزحية لعمل فتحة مخرج كبيرة في الأذين الأيمن. احرص على عدم إتلاف الأبهر النازل. عند هذه النقطة، يصبح الحيوان جاهزًا للتروية.
قم بتوصيل إبرة التروية الموجودة في الأذين الأيمن بفتحة المراقبة دون إدخال أي فقاعات هوائية، ثم افتح فتححة المراقبة. بعد ذلك، قم بنفخ كرة المانومتر بسرعة وبشكل متساوٍ حتى يصل الضغط إلى 80 millimeters of mercury. حافظ على هذا الضغط طوال فترة حقن المحلول المنظم.
ابدأ الآن بتشغيل المؤقت. اضبط زاوية الإبرة بحيث يكون التدفق في أقوى حالاته، وعندما يقترب المحلول المنظم من النفاد، قم بتحويل صمام المحلول المنظم. سيبدأ السائل في الجريان بشكل صافٍ عندما يتم تروية الكبد.
يعد هذا مؤشراً على التروية الجيدة، ويجب تدوين وقت خلو الكبد من السائل بسرعة كبيرة. بعد هذا الحدث، ستُلاحظ رعشات التثبيت؛ حدد هذا الوقت كزمن التثبيت الحقيقي. وللحفاظ على معدل تدفق ثابت، يمكن زيادة الضغط تدريجياً ليصل إلى حد أقصى قدره 130 millimeters of mercury.
بمجرد انتهاء عملية التثبيت تقريباً، أغلق صمام المخرج وسجل الوقت. يجب أن يكون جسم الجرذ الآن متصلباً. يمكن الآن استئصال أعضاء الجرذ. لإزالة الدماغ، ابدأ بتشريح الجرذ المثبت عن طريق فصل الرأس باستخدام المقصلة.
بعد ذلك، قم بإجراء شق في الخط المتوسط على طول الغطاء الجلدي من الرقبة إلى الأنف، وكشف الجمجمة باستخدام مقصات الفم. قم بقص عضلات الرقبة المتبقية بحيث يتم الكشف عن قاعدة الجمجمة. ضع الطرف الحاد لمقصات القزحية في الثقبة العظمى من أحد الجانبين، مع تحريك المقصات بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة.
بعد ذلك، قم بإجراء قطع يمتد إلى الحافة القاصية لسطح الجمجمة الخلفي. قم بإجراء قطع مماثل على الجانب المقابل. ثم استخدم الملاقط لإزالة عظام الجمجمة المحيطة بالمخيخ.
قم بتمرير طرف المقص بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة من الزاوية الخلفية القاصية الظهرية إلى الحافة الجبهية القاصية. تجنب إتلاف الدماغ عن طريق رفع طرف الشفرة للأعلى. خلال هذه العملية، كرر هذه الخطوة بالقص على الجانب المقابل.
بعد ذلك، وباستخدام الملاقط، قم بتقشير السطح الظهري للجمجمة بعيداً عن الدماغ. قم بقص جوانب الجمجمة باستخدام الملاقط أيضاً. الآن، وباستخدام ملعقة مختبرية (spatula)، اقطع البصلات الشمية والوصلات العصبية على طول السطح البطني للدماغ، ثم افصل الدماغ برفق عن الرأس.
باستخدام مقص القزحية، قم بقص أي جزء من الأم الجافية التي تربط الدماغ بالجمجمة. وبمجرد إزالة الدماغ، ضعه في قارورة تحتوي على سائل تثبيت يكون حجمه 10 أضعاف حجم الدماغ على الأقل. تُحفظ القارورة في درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة.
بعد مرور 24 ساعة، اغسل الدماغ باستخدام PBS ثلاث مرات مع التحريك اللطيف. يمكن بعد ذلك تخزين الدماغ في PBS أو محلول Hanks المتوازن. وعند إضافة أزيد الصوديوم، يمكن تخزين الأدمغة في درجة حرارة أربعة درجات Celsius لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
غير مقطعة. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إتمام عملية التروية بأكملها في غضون خمس إلى ثماني دقائق.