El objetivo general de este procedimiento es demostrar nuestra técnica de fijación por perfusión que enfatiza el uso de presiones fisiológicas para preservar adecuadamente el tejido cerebral de rata para procedimientos de inmunohistoquímica. Primero, se muestra el uso y montaje del aparato de perfusión. Luego, se reúnen las herramientas necesarias para realizar tanto la cirugía de perfusión como la extracción del cerebro, y el animal profundamente anestesiado se coloca en una bandeja poco profunda llena de hielo triturado.

Se realiza una incisión lateral de cinco a seis centímetros a través del tegumento y la pared abdominal, justo debajo de la caja torácica. Se expone el corazón y se realiza la perfusión del animal. El paso final consiste en extraer el cerebro y colocarlo en un frasco con líquido fijador que contenga al menos 10 veces el volumen del cerebro mismo.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar nuestra técnica de fijación por perfusión que enfatiza el uso de presiones fisiológicas para preservar adecuadamente el tejido cerebral de rata para inmunohistoquímica. Comenzaremos preparando el sistema de perfusión. Esto tomará aproximadamente 10 minutos. Utilizando una jeringa de 50 mililitros, enjuague y limpie repetidamente la línea de fijador con tampón hasta eliminar todas las burbujas de aire.

Es fundamental para el éxito de una perfusión no tener burbujas de aire en ninguna de las líneas. Esto se logra colocando la válvula de salida en un vaso de precipitados lleno de tampón. Ahora, cierre la válvula de salida.

Luego retire el tubo de la jeringa mientras lo comprime para que una gota de tampón quede colgando del extremo. Coloque el tubo lleno, con la entrada del fijador, en un frasco que contenga 200 mililitros de fijador de paraldehído por animal. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire.

Ajuste la tapa, asegurándose de que la junta esté correctamente colocada. Si no está colocada adecuadamente, la presión dentro del sistema cerrado no se mantendrá. Coloque la botella en el dispositivo de perfusión.

Establezca el flujo solo desde la línea de tampón cerrando el puerto de salida y girando la válvula de tampón a la misma posición que la válvula del fijador. Abra el puerto de salida y purgue la línea de tampón como se hizo anteriormente con la línea del fijador. Una vez purgada la línea, coloque el tubo dentro del frasco de tampón.

A continuación, pruebe la capacidad del sistema para mantener la presión. Al bombear la perilla de goma del manómetro, habrá resistencia. Como preparación final.

Llene la aguja de perfusión con tampón para evitar la introducción de aire. El sistema ya está listo para la perfusión. Después de administrar una mezcla de ketamina y xilacina sin verificar el nivel quirúrgico de anestesia mediante el método de pellizco en el dedo del pie, coloque la rata completamente anestesiada sobre una bandeja poco profunda llena de hielo triturado.

No continúe a menos que el animal esté completamente anestesiado. Comience la cirugía con una incisión lateral de cinco a seis centímetros a través del tegumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica. Separe cuidadosamente el hígado del diafragma.

Realice una pequeña incisión en el diafragma utilizando tijeras curvas romas. La posición y la presión de su dedo pueden ayudar a cortar el diafragma. Continúe la incisión del diafragma a lo largo de toda la extensión de la caja torácica para exponer la cavidad pleural.

Coloque tijeras romas curvas a lo largo de un lado de las costillas, desplazando cuidadosamente los pulmones, y realice un corte a través de la caja torácica hasta la clavícula. Luego, haga un corte similar en el lado contralateral. Ahora levante el esternón y recorte cuidadosamente cualquier tejido que lo conecte al corazón.

Sujete con una pinza hemostática la punta del esternón y coloque la pinza sobre la cabeza. El tórax se elevará, proporcionando una vista clara de los vasos principales. Con tijeras de iris, realice una pequeña incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo.

Pase una aguja de perfusión romo de 15 gauge o con punta de oliva a través del ventrículo cortado hacia la aorta ascendente. La punta debe ser visible a través de la pared de la aorta y no debe llegar al arco aórtico, donde divergen las arterias braquial y carótida. Para asegurar la aguja y evitar fugas, sujete el corazón con una pinza hemostática.

Finalmente, utilice las tijeras de iris para hacer una abertura grande en la aurícula derecha. Tenga cuidado de no dañar la aorta descendente. En este momento, el animal está listo para ser perfundido.

Sujete la aguja de perfusión en la aurícula derecha al puerto de salida sin introducir burbujas de aire y abra el puerto de salida. Luego, bombee rápida y uniformemente la perilla del manómetro hasta una presión de 80 milímetros de mercurio. Mantenga esta presión durante todo el período de infusión del tampón.

Ahora inicie un cronómetro. Ajuste el ángulo de la aguja al punto donde el flujo sea más intenso y, cuando el tampón esté casi agotado, cambie la válvula del tampón. El líquido comenzará a salir claro cuando el hígado esté perfundido.

Esto indica una buena perfusión y debe anotarse rápidamente el momento en que el hígado se aclara. Tras este evento, se observarán temblores de fijación. Indique esto como el momento de la fijación verdadera. Para mantener un caudal constante, la presión puede aumentarse gradualmente hasta un máximo de 130 milímetros de mercurio.

Una vez que el fijador esté casi terminado, cierre la válvula de salida y anote la hora. En este momento, la rata debe estar rígida. Ahora pueden extraerse los órganos de la rata. Para extraer el cerebro, comience la disección de la rata fijada retirando la cabeza mediante una guillotina.

A continuación, realice una incisión media a lo largo del tejido desde el cuello hasta la nariz y exponga el cráneo con tijeras, orales. Recorte el músculo restante del cuello para exponer la base del cráneo. Coloque el extremo afilado de un par de tijeras de iris en el foramen magno de un lado, deslizando cuidadosamente las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo.

A continuación, realice un corte que se extienda hasta el borde distal de la superficie posterior del cráneo. Haga un corte idéntico en el lado contralateral. Luego, use el tereos para eliminar el cráneo alrededor del cerebelo.

Deslice cuidadosamente la punta de las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo desde la esquina dorsal distal posterior hasta el reborde frontal distal. Evite dañar el cerebro levantando la punta de la hoja. Durante este proceso, repita esto, cortando en el lado opuesto.

Luego, utilizando pinzas, retire la superficie dorsal del cráneo desde el cerebro. Recorte los lados del cráneo también con pinzas. Ahora, usando una espátula, corte los bulbos olfativos y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro y separe suavemente el cerebro de la cabeza.

Con tijeras de iris, corte cualquier duramadre que conecte el cerebro con el cráneo. Una vez extraído el cerebro, colóquelo en un frasco con fijador que tenga un volumen de al menos 10 veces el del cerebro. Almacene el frasco a cuatro grados Celsius durante 24 horas.

Después de 24 horas, lave el cerebro con PBS tres veces con agitación suave. Luego, el cerebro puede almacenarse en PBS o en la solución salina de Hanks. Con azida sódica a cuatro grados Celsius, los cerebros pueden conservarse hasta tres meses.

Un seccionado. Una vez dominado, toda la perfusión podría completarse entre cinco y ocho minutos.