L'objectif général de cette procédure est de démontrer notre technique de fixation par perfusion, qui met l'accent sur l'utilisation de pressions physiologiques afin de préserver correctement le tissu cérébral de rat pour des procédures d'immunohistochimie. Premièrement, l'utilisation et la mise en place de l'appareil de perfusion sont démontrées. Ensuite, les outils nécessaires pour réaliser à la fois la chirurgie de perfusion et l'extraction du cerveau sont rassemblés, et l'animal profondément anesthésié est placé dans un bac peu profond rempli de glace pilée.

Une incision latérale de cinq à six centimètres est pratiquée à travers l'intégument et la paroi abdominale, juste sous la cage thoracique. Le cœur est exposé et l'animal est perfusé. La dernière étape consiste à retirer le cerveau et à le placer dans un flacon contenant un liquide fixateur dont le volume est d'au moins dix fois supérieur à celui du cerveau lui-même.

L'objectif général de cette procédure est de démontrer notre technique de fixation par perfusion qui met l'accent sur l'utilisation de pressions physiologiques afin de préserver correctement le tissu cérébral de rat pour l'immunohistochimie. Nous commencerons par préparer le dispositif de perfusion. Cette étape prendra environ 10 minutes. À l’aide d’une seringue de 50 millilitres, rincez et purgez à plusieurs reprises la ligne de fixatif avec du tampon jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées.

Il est essentiel, pour la réussite d'une perfusion, qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans les tubulures. Pour y parvenir, placez le robinet de sortie dans un bécher rempli de tampon. Fermez maintenant le robinet de sortie.

Ensuite, retirez le tube de la seringue tout en le comprimant pour qu'une goutte de tampon reste suspendue à l'extrémité. Placez le tube rempli, l'entrée du fixateur, dans un flacon contenant 200 millilitres de fixateur paraldéhyde par animal. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air.

Serrer le bouchon en veillant à ce que le joint soit correctement en place. S'il n'est pas bien positionné, la pression à l'intérieur du système fermé ne sera pas maintenue. Placer la bouteille dans le dispositif de perfusion.

Régler le débit uniquement à partir de la ligne de tampon en fermant le port de sortie et en tournant la vanne de tampon à la même position que la vanne de fixateur. Ouvrir le port de sortie et purger la ligne de tampon comme précédemment effectué pour la ligne de fixateur. Une fois la ligne purgée, placer le tube dans la bouteille de tampon.

Ensuite, tester la capacité du système à maintenir la pression. En actionnant l'ampoule en caoutchouc du manomètre, une résistance doit être ressentie. Comme dernière étape de préparation.

Remplissez l’aiguille de perfusion avec du tampon afin d’éviter l’introduction d’air. Le système est désormais prêt pour la perfusion. Après avoir administré un mélange de kétamine et de xylazine non vérifié pour un niveau chirurgical d’anesthésie par la méthode de la pincée de l’orteil, placez le rat complètement anesthésié sur un plateau peu profond rempli de glace pilée.

Ne pas continuer si l'animal n'est pas complètement anesthésié. Commencer la chirurgie par une incision latérale de cinq à six centimètres à travers l'intégument et la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique. Séparer soigneusement le foie du diaphragme.

Pratiquer une petite incision dans le diaphragme à l’aide de ciseaux courbes effilés. La position et la pression exercée par votre doigt peuvent faciliter la coupe du diaphragme. Poursuivre l’incision le long de toute la longueur de la cage thoracique afin d’exposer la cavité pleurale.

Placer des ciseaux émoussés incurvés le long d'un côté des côtes, déplacer soigneusement les poumons et pratiquer une incision à travers la cage thoracique jusqu'à la clavicule. Ensuite, effectuer une incision similaire du côté controlatéral. Soulever maintenant le sternum et sectionner délicatement tout tissu le reliant au cœur.

Fixer avec la pince hémostatique l'extrémité du sternum et placer la pince au-dessus de la tête. Le Thur devrait se soulever, offrant ainsi une vue claire des principaux vaisseaux. À l’aide de ciseaux iris, pratiquer une petite incision à l’extrémité postérieure du ventricule gauche.

Faire passer une aiguille de perfusion émoussée ou à extrémité olivaire de calibre 15 à travers le ventricule sectionné jusqu'à l'aorte ascendante. La pointe doit être visible à travers la paroi de l'aorte et ne doit pas atteindre l'arc aortique où divergent les artères brachiale et carotide. Pour fixer l'aiguille et éviter toute fuite, pincer le cœur avec une pince hémostatique.

Enfin, utilisez les ciseaux à iris pour créer une large ouverture dans l'oreillette droite. Veillez à ne pas endommager l'aorte descendante. À ce stade, l'animal est prêt à être perfusé.

Fixer l'aiguille de perfusion dans l'oreillette droite au port de sortie sans introduire de bulles d'air et ouvrir le port de sortie. Ensuite, pomper rapidement et uniformément le bulbe du manomètre jusqu'à une pression de 80 millimètres de mercure. Maintenir cette pression pendant toute la durée de l'infusion du tampon.

Démarrer maintenant un chronomètre. Ajuster l'angle de l'aiguille afin que le débit soit maximal, et lorsque le tampon est presque épuisé, changer la vanne de tampon. Le liquide commence à devenir clair lorsque le foie est perfusé.

Ceci indique une bonne perfusion, et le moment où le foie devient clair doit être noté très rapidement. Après cet événement, des tremblements de fixation seront observés. Indiquez ce moment comme étant celui de la fixation réelle. Pour maintenir un débit constant, la pression peut être augmentée progressivement jusqu’à un maximum de 130 millimètres de mercure.

Une fois que le fixateur est presque terminé, fermez la vanne de sortie et notez l'heure. Le rat doit maintenant être rigide. Les organes du rat peuvent désormais être prélevés. Pour retirer le cerveau, commencez la dissection du rat fixé en détachant la tête à l’aide d’une guillotine.

Ensuite, réalisez une incision médiane le long de l'intégument, de la nuque jusqu'au nez, et exposez le crâne à l'aide de ciseaux oraux. Retirez les muscles résiduels de la nuque afin d'exposer la base du crâne. Insérez l'extrémité pointue d'une paire de ciseaux à iris dans le foramen magnum d'un côté, puis faites glisser délicatement les ciseaux le long de la surface interne du crâne.

Ensuite, effectuez une incision s'étendant jusqu'au bord distal de la surface postérieure du crâne. Réalisez une incision identique du côté controlatéral. Puis utilisez le theros pour enlever le crâne autour du cervelet.

Faites glisser soigneusement la pointe des ciseaux le long de la surface interne du crâne, depuis le coin postérieur distal dorsal jusqu'à la saillie frontale distale. Évitez d'endommager le cerveau en soulevant la pointe de la lame. Pendant cette opération, répétez l'opération en coupant du côté opposé.

Ensuite, à l'aide de pinces, détacher la surface dorsale du crâne du cerveau. Retirer les côtés du crâne également à l'aide de pinces. Puis, à l'aide d'une spatule, sectionner les bulbes olfactifs et les connexions nerveuses le long de la surface ventrale du cerveau, puis dégager délicatement le cerveau de la tête.

À l’aide de ciseaux à iridectomie, sectionez toute dure-mère reliant le cerveau au crâne. Une fois le cerveau retiré, placez-le dans un flacon de fixateur dont le volume est d’au moins 10 fois supérieur à celui du cerveau. Conservez le flacon à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.

Après 24 heures, laver le cerveau 3 fois avec du PBS en agitant doucement. Le cerveau peut ensuite être conservé dans du PBS ou du Hanks. Avec de l'azoture de sodium à quatre degrés Celsius, les cerveaux peuvent être conservés pendant trois mois.

Une fois maîtrisée, la perfusion entière peut être réalisée entre cinq et huit minutes.