המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את טכניקת קיבוע הפרפוזיה שלנו, המדגישה שימוש בלחצים פיזיולוגיים כדי לשמר כראוי רקמת מוח של חולדה לצורך פרוצדורות של אימונוהיסטוכימיה. ראשית, מודגמים השימוש וההגדרה של מכשיר הפרפוזיה. לאחר מכן, נאספים הכלים הדרושים לביצוע הן של ניתוח הפרפוזיה והן של הוצאת המוח, והחיה המורדמת עמוק מונחת במגש רדוד מלא בקרח גרוס.
מבצעים חתך צדי של חמישה עד שישה סנטימטרים דרך העור ודופן הבטן, ממש מתחת לכלוב הצלעות. חושפים את הלב ומבצעים פירפוזיה לבעל החיים. השלב האחרון הוא הוצאת המוח והנחתו במבחנה עם נוזל מקבע בנפח הגדול פי 10 לפחות מנפח המוח עצמו.
המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את טכניקת הקיבוע בפרפוזיה שלנו, המדגישה את השימוש בלחצים פיזיולוגיים כדי לשמר כראוי רקמת מוח של חולדה עבור אימונוהיסטוכימיה. נתחיל בהכנת מערך הפרפוזיה. תהליך זה יארך כ-10 דקות. בעזרת מזרק של 50 milliliter, שטפו שוב ושוב את קו הקיבוע עם באפר עד להסרת כל בועות האוויר.
להצלחת הפרפוזיה חיוני למנוע הופעת בועות אוויר בכל אחד מהקוים. דבר זה מושג על ידי הנחת שסתום היציאה בתוך כלי כימי המלא בבופר. כעת, סגרו את שסתום היציאה.
לאחר מכן, הוצא את המבחנה מהמזרק תוך כדי לחיצה עליו, כך שטיפה של באפר תישאר תלויה מקצהו. הכנס את הצינור המלא, כאשר פתח המקבע נמצא בתוך בקבוק המכיל 200 milliliters של מקבע פאראלדהיד לכל חיה. יש להקפיד לא להחדיר בועות אוויר.
הדק את הפקק, וודא שהאטם יושב כראוי. אם הוא אינו יושב כראוי, הלחץ בתוך המערכת הסגורה לא יישמר. הנח את הבקבוק בתוך מתקן הפרפוזיה.
הגדירו את הזרימה מקו התמיס הרצוף (buffer) בלבד על ידי סגירת פתח היציאה וסיבוב שסתום התמיס הרצוף לאותה מיקום של שסתום המקבע (fixative). פתחו את פתח היציאה ונקו את קו התמיס הרצוף כפי שבוצע קודם לכן עבור קו המקבע. לאחר ניקוי הקו, הכניסו את הצינור לבקבוק התמיס הרצוף.
בשלב הבא, בדקו את יכולתו של המערכת להחזיק לחץ. בעת שאיבה של נורת גומי של המנומטר, תורגש התנגדות. כהכנה סופית.
מלאו את מחט הפרפוזיה בבופר כדי למנוע חדירת אוויר. המערכת מוכנה כעת להפרפוזיה. לאחר מתן תערובת של ketamine ו-xylazine, תוך וידוא הגעה למישור הרדמה כירורגי באמצעות שיטת צביטת בהונות, הניחו את החולדה המורדמת באופן מלא על מגש רדוד מלא בקרח גרוס.
אין להמשיך אלא אם בעל החיים נמצא תחת הרדמה מלאה. התחילו את הניתוח בחתך צדי של חמישה עד שישה סנטימטרים דרך העור ודופן הבטן, ממש מתחת לכלוב הצלעות. הפרידו בזהירות את הכבד מהסרעפת.
בצעו חתך קטן בסרעפת באמצעות המספריים הקעורות והקהות. מיקום האצבע והלחץ שהיא מפעילה יכולים לסייע ביכולת לחתוך את הסרעפת. המשיכו בחתך הסרעפת לאורך כל בית הצלעות כדי לחשוף את חלל הפלורה.
הנח מספריים קהים ומעוקלים לאורך צדו של כלוב הצלעות, הדחק בזהירות את הריאות ובצע חיתוך דרך כלוב הצלעות עד לעצם הבריח. לאחר מכן, בצע חיתוך דומה בצד הנגדי. כעת הרם את עצם החזה והסר בזהירות כל רקמה המחברת אותה ללב.
סגור את קצה העצם החזה (sternum) באמצעות המוסטט והנח את ההמוסטט מעל הראש. החזה אמור להיות מורם, ובכך יסופק מבט ברור על כלי הדם הראשיים. באמצעות מספרי איריס (iris scissors), בצע חתך קטן בקצה האחורי של החדר השמאלי.
העבירו מחט פרפוזיה בעלת קצה קהה או קצה זית (olive tipped) בכילוי 15, דרך החתך בחדר אל תוך האורטה העולה. קצה המחט צריך להיות גלוי דרך דופן האורטה ואסור שיגיע לקשת האורטה, שם מיתforks העורקים הברכיאליים והקרטידיים. כדי לקבע את המחט ולמנוע דליפות, סגרו את הלב באמצעות המוסטט.
לבסוף, השתמש במספרי איריס כדי ליצור פתח גדול בעלייה הימנית. הקפד לא לפגוע באורטה היורדת. בשלב זה, בעל החיים מוכן לביצוע פרפוזיה.
חברו את מחט הפרפוזיה בעלייה הימנית לפתח היציאה (outlook port) ללא הכנסת בועות אוויר, ופתחו את פתח היציאה. לאחר מכן, נפחו במהירות ובאופן אחיד את פלבלב המנומטר עד ללחץ של 80 millimeters of mercury. שמרו על לחץ זה לאורך כל תקופת הזרקת הבאפר.
כעת הפעילו טיימר. כווננו את זווית המחט לנקודה שבה הזרימה היא החזקה ביותר, וכאשר הבופר כמעט נגמר, העבירו את שסתום הבופר. הנוזל יתחיל לזרום בצורה צלולה כאשר הכבד יעבור פרפוזיה.
זהו סימן לפרפוזיה טובה ויש לרשום את הזמן שבו הכבד התנקה במהירות רבה. לאחר אירוע זה, יבחנו רעידות קיבוע. סמנו זאת כזמן הקיבוע האמיתי. כדי לשמור על קצב זרימה קבוע, ניתן להעלות את הלחץ בהדרגה עד למקסימום של 130 millimeters of mercury.
כאשר המקבע כמעט נגמר, סגור את שסתום היציאה ורשום את הזמן. החולדה צריכה להיות כעת קשיחה. כעת ניתן להוציא את איברי החולדה. כדי להוציא את המוח, התחל בניתוח של החולדה המקובעת על ידי הסרת הראש באמצעות גיליוטינה.
בשלב הבא, בצעו חתך בקו האמצע לאורך העור מהצוואר ועד לאף, וחשפו את הגולגולת באמצעות מספריים. גזרו את שרירי הצוואר הנותרים כך שבסיס הגולגולת יהיה חשוף. הכניסו את הקצה החד של מספרי איריס לתוך ה-foramen magnum מצד אחד, והחליקו את המספריים בזהירות לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת.
בשלב הבא, בצעו חתך המגיע עד לקצה הדיסטלי של פני הגולגולת האחוריים. בצעו חתך זהה בצד הקונטרלטרלי. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה (theros) כדי להסיר את הגולגולת מסביב למוחון.
החליקו בזהירות את קצה המספריים לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת, מהפינה האחורית-דיסטלית הגבית (dorsal distal posterior) ועד למדף הפרונטלי הדיסטלי (distal frontal ledge). הימנעו מפגיעה במוח על ידי הרמה של קצה הלהב. במהלך תהליך זה, חזרו על פעולה זו וגזרו בצד הנגדי.
לאחר מכן, בעזרת פינצטות, קלפו את פני השטח הגביים (דורסליים) של הגולגולת מהמוח. הסִירו את צדדי הגולגולת בעזרת פינצטות גם כן. כעת, בעזרת שפכטל, נתקו את הפקעות הריח ואת הקשרים העצביים לאורך פני השטח הבטניים (ונטרליים) של המוח, והפרידו בעדינות את המוח מהראש.
בעזרת מספרי איריס, גזרו כל קשרי קשקש (dura) המחברים את המוח לגולגולת. לאחר הוצאת המוח, הניחו אותו במבחנה עם נוזל קיבוע שנפחו גדול פי 10 לפחות מנפח המוח עצמו. אחסנו את המבחנה בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך 24 שעות.
לאחר 24 שעות, שטפו את המוח עם PBS שלוש פעמים תוך כדי סיבוב עדין. לאחר מכן ניתן לשמור את המוח ב-PBS או ב-Hanks. בנוכחות sodium azide ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ניתן לשמור את המוחות למשך שלושה חודשים.
ללא חיתוך. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את כל תהליך הפרפוזיה תוך חמש עד שמונה דקות.