本手順の全体的な目的は、免疫組織化学的手法のためにラットの脳組織を適切に保存できるよう、生理学的圧力を重視した灌流固定技術を実演することです。まず、灌流装置の使用方法とセットアップについて説明します。次に、灌流手術および脳摘出に必要な器具を準備し、深く麻酔した動物を砕氷を満たした浅いトレイに配置します。
肋骨弓の直下で、皮膚および腹壁に5〜6 cmの側切開を加えます。心臓を露出させ、動物に灌流を行います。最後に、脳を取り出し、脳自体の体積の少なくとも10倍の液量を含む固定液のバイアルに入れます。
この手順の全体的な目的は、免疫組織化学染色に向けてラットの脳組織を適切に保存するために、生理学的圧力を重視した灌流固定法を実演することです。まず、灌流装置の準備から始めます。これには約10分かかります。50 mLのシリンジを使用し、すべての気泡が除去されるまで、固定液ラインをバッファーで繰り返し洗浄し、クリアにします。
灌流を成功させるには、いずれのラインにも気泡が存在しないことが極めて重要です。これは、流出口バルブを緩衝液で満たしたビーカーの中に配置することで達成されます。次に、流出口バルブを閉じます。
次に、チューブの端にバッファーが1滴垂れるようにチューブを絞りながら、シリンジからチューブを取り出します。充填されたチューブの固定液入口を、動物1匹あたり 200 milliliters のパラアルデヒド固定液が入ったボトルに入れます。この際、気泡が入らないように注意してください。
シールが適切に密着していることを確認しながら、キャップを締めます。適切に密着していない場合、密閉系内の圧力が維持されません。ボトルを灌流装置にセットします。
アウトレットポートを閉じ、バッファーバルブを固定液バルブと同じ位置に回して、バッファーラインのみからフローを設定します。アウトレットポートを開き、固定液ラインのときと同様にバッファーラインを洗浄します。ラインの洗浄が完了したら、チューブをバッファーボトルに入れます。
次に、システムの耐圧性を確認します。ゴム製のマノメーターバルブをポンプすると、抵抗が感じられます。これで最終準備が完了です。
気泡の混入を防ぐため、灌流針をバッファーで満たします。これで灌流の準備が整いました。つま先でのピンチテストにより手術麻酔面にあることを確認し、ケタミン・キシラジン混合液を投与した後、完全に麻酔したラットを砕氷を満たした浅いトレイの上に置きます。
動物が完全に麻酔されたことを確認してから、次の工程に進んでください。肋骨縁の直下で、皮膚および腹壁に5〜6 cmの側方切開を加え、手術を開始します。横隔膜から肝臓を慎重に分離します。
曲がった鈍端剪刀を用いて、横隔膜に小さな切開を加えます。指の位置と圧力を調整することで、横隔膜を切りやすくすることができます。胸腔を露出させるため、肋骨に沿って横隔膜の切開を全長にわたって継続します。
湾曲した鈍端剪刀を肋骨の片側に沿わせ、肺を慎重にずらしながら、肋骨を切り開き、鎖骨まで切断します。次に、反対側でも同様に切断します。その後、胸骨を持ち上げ、心臓に接続している組織を慎重に切り離します。
止血鉗子で胸骨の先端をクランプし、止血鉗子を頭側へ移動させます。これにより胸骨が持ち上がり、主要血管が明確に見えるようになります。アイリス剪刀を用いて、左心室の後端に小さな切開を加えます。
15ゲージの鈍端またはオリーブチップの灌流針を、切開した心室から上行大動脈へと挿入します。針先は大動脈壁を通して視認できる必要がありますが、腕動脈と頸動脈が分岐する大動脈弓まで達してはいけません。針を固定し、漏れを防ぐために、止血鉗子で心臓をクランプします。
最後に、アイリス剪刀を用いて右心房に大きな開口部を作ります。この際、下行大動脈を損傷しないよう注意してください。これで、動物の灌流準備が整いました。
右心房にある灌流針を、気泡が入らないようにアウトルックポートに接続し、アウトルックポートを開きます。次に、マノメーターバルブを素早く均一にポンプし、圧力を 80 millimeters of mercury まで上げます。緩衝液の注入期間中、この圧力を維持してください。
ここでタイマーを開始します。流量が最大になるように針の角度を調整し、バッファーがほぼ終了した時点でバッファーバルブを切り替えます。肝臓の灌流が完了すると、流出液が透明になり始めます。
これは灌流が良好であることを示しており、肝臓の脱色時間を速やかに記録してください。この後、固定震顫（しゅしん）が観察されます。これを真の固定時間として記録してください。流量を一定に維持するため、圧力は最大130 millimeters of mercuryまで徐々に上げることができます。
固定液がほぼ使い切られたところで、流出口のバルブを閉め、時間を記録します。この時点でラットの体は硬くなっているはずです。これでラットの臓器を採取することができます。脳を取り出すには、ギロチンを用いて頭部を切り離し、固定したラットの解剖を開始します。
次に、頸部から鼻にかけて外皮に正中切開を加え、ハサミを用いて頭蓋骨を露出させます。頭蓋底が露出するように、残りの頸筋を切り取り除きます。アイリスシザーズの鋭い先端を片側の大後頭孔に入れ、頭蓋骨の内面に沿って慎重にハサミを滑らせます。
次に、後頭蓋表面の遠位端まで切開します。反対側でも同様に切開します。その後、テロスを用いて小脳周囲の頭蓋骨を除去します。
ハサミの先端を、頭蓋骨の内表面に沿って、背側遠位後方角から遠位前頭縁まで慎重に滑らせます。刃先を持ち上げて脳を傷つけないように注意してください。この操作の後、反対側でも同様に切開を繰り返します。
次に、ピンセットを用いて、脳から頭蓋骨の背面を剥離します。同様にピンセットで頭蓋骨の側面を切り取り、取り除きます。続いて、スパチュラを用いて、脳の腹側にある嗅球と神経接続を切断し、脳を頭部から慎重に分離させます。
アイリスシザーを用いて、脳と頭蓋骨を連結している硬膜を切断します。脳を取り出した後、脳自体の体積の少なくとも10倍以上の量の固定液が入ったバイアルに入れます。このバイアルを4°Cで24時間保存します。
24時間後、脳をPBSで3回、緩やかに揺らしながら洗浄します。その後、脳はPBSまたはヘインクス液（Hanks' balanced salt solution）に保存できます。アジ化ナトリウムを加えた4°Cの条件下では、脳を3か月間保存することが可能です。
切断せずに行います。習熟すれば、灌流全体を5〜8分で完了させることができます。