본 절차의 전반적인 목적은 면역조직화학적 분석 절차를 위해 쥐의 뇌 조직을 적절히 보존할 수 있도록 생리학적 압력의 활용을 강조하는 관류 고정 기술을 시연하는 것입니다. 먼저, 관류 장치의 사용법과 설치 방법이 제시됩니다. 그다음 관류 수술과 뇌 적출에 필요한 도구들을 준비하고, 깊게 마취된 동물을 부순 얼음이 채워진 얕은 트레이에 놓습니다.

갈비뼈 바로 아래의 피부와 복벽을 통해 5~6cm 길이의 외측 절개를 수행합니다. 심장을 노출시킨 후 동물을 관류합니다. 마지막 단계로 뇌를 적출하여 뇌 부피의 최소 10배 이상의 고정액이 담긴 바이알에 넣습니다.

이 실험 절차의 전반적인 목적은 면역조직화학 염색을 위해 쥐의 뇌 조직을 적절하게 보존할 수 있도록 생리학적 압력의 활용을 강조하는 저희의 관류 고정 기술을 시연하는 것입니다. 먼저 관류 장치를 준비하며, 이 과정에는 약 10분이 소요됩니다. 50 milliliter 주사기를 사용하여 모든 기포가 제거될 때까지 완충액으로 고정액 라인을 반복적으로 세척하고 비웁니다.

관류를 성공적으로 수행하려면 모든 라인에 공기 방울이 없어야 합니다. 이는 배출 밸브를 버퍼가 채워진 비커 속에 넣음으로써 가능합니다. 이제 배출 밸브를 닫으십시오.

그런 다음 시린지를 짜내어 튜브 끝에 버퍼 한 방울이 맺히게 한 상태에서 시린지로부터 튜브를 제거합니다. 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하며, 고정액 입구가 동물당 200 milliliters의 파라알데히드(paraldehyde) 고정액이 담긴 병에 잠기도록 채워진 튜브를 넣습니다.

씰이 제대로 안착되었는지 확인하며 캡을 조입니다. 씰이 제대로 안착되지 않으면 밀폐 시스템 내의 압력이 유지되지 않습니다. 병을 관류 장치에 배치합니다.

배출 포트를 닫고 버퍼 밸브를 고정액 밸브와 동일한 위치로 돌려 버퍼 라인에서만 흐름이 설정되도록 합니다. 배출 포트를 열고 이전에 고정액 라인에서 수행한 것과 동일하게 버퍼 라인을 비웁니다. 라인이 비워지면 튜브를 버퍼 병에 넣습니다.

다음으로, 시스템의 압력 유지 능력을 테스트합니다. 고무 마노미터 벌브를 펌핑하면 저항이 느껴질 것입니다. 마지막 준비 단계입니다.

공기 유입을 방지하기 위해 관류 바늘을 버퍼로 채웁니다. 이제 시스템이 관류 준비가 되었습니다. 발가락 꼬집기법(toe pinch method)을 통해 수술적 마취 단계에 도달했음을 확인하며 케타민-자일라진 혼합물을 투여한 후, 완전히 마취된 쥐를 부서진 얼음이 채워진 얕은 트레이 위에 놓습니다.

동물이 완전히 마취될 때까지 기다린 후 진행하십시오. 갈비뼈 바로 아래의 피부와 복벽을 통해 5~6cm 길이로 측면 절개를 하여 수술을 시작합니다. 횡격막에서 간을 조심스럽게 분리하십시오.

곡선 뭉툭한 가위(curved blunt scissors)를 사용하여 횡격막에 작은 절개를 만듭니다. 손가락의 위치와 압력을 조절하면 횡격막을 더 쉽게 절개할 수 있습니다. 늑골 전체 길이를 따라 횡격막 절개를 계속하여 흉강을 노출시킵니다.

굽은 뭉툭한 가위(curved blunt scissors)를 갈비뼈 한쪽 면에 대고, 폐를 조심스럽게 밀어낸 후 쇄골까지 흉곽을 따라 절개합니다. 그다음 반대편에서도 동일하게 절개합니다. 이제 흉골을 들어 올리고 심장과 연결된 조직을 조심스럽게 제거합니다.

지혈鉗子(hemostat)로 흉골 끝부분을 집어 머리 쪽으로 옮겨 고정합니다. 이렇게 하면 흉골이 들어 올려지며 주요 혈관들이 명확하게 보입니다. 아이리스 가위(iris scissors)를 사용하여 좌심실의 후단에 작은 절개를 넣습니다.

15 gauge 둔탁한 바늘 또는 올리브 팁 관류 바늘을 절개된 뇌실을 통해 상행 대동맥으로 통과시킵니다. 바늘 끝이 대동맥 벽을 통해 보여야 하며, 상완동맥과 경동맥이 분기되는 대동맥궁까지 닿지 않아야 합니다. 바늘을 고정하고 누출을 방지하기 위해 지혈鉗(hemostat)으로 심장을 집습니다.

마지막으로, 아이리스 가위를 사용하여 우심방에 커다란 배출구를 만듭니다. 이때 하행 대동맥이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 동물의 관류 준비가 완료되었습니다.

공기 방울이 유입되지 않도록 우심방의 관류 바늘을 아웃룩 포트에 연결하고 아웃룩 포트를 엽니다. 그다음 마노미터 벌브를 빠르고 균일하게 펌핑하여 압력을 80 mmHg까지 높입니다. 완충액 주입 기간 동안 이 압력을 일정하게 유지하십시오.

이제 타이머를 시작하십시오. 흐름이 가장 강한 곳으로 바늘 각도를 조절하고, 완충액이 거의 다 소모되었을 때 완충액 밸브를 전환하십시오. 간에 관류가 이루어지면 액체가 맑게 흐르기 시작할 것입니다.

이는 관류가 잘 되고 있음을 나타내며, 간의 색이 투명해지는 시점을 매우 빠르게 기록해야 합니다. 이 현상 이후에 고정 떨림이 관찰될 것입니다. 이때를 실제 고정 시점으로 표시하십시오. 일정한 유량을 유지하기 위해, 압력을 최대 130 mmHg까지 점진적으로 높일 수 있습니다.

고정액이 거의 다 소진되면 배출 밸브를 닫고 시간을 기록합니다. 이제 쥐의 몸이 굳어 있어야 합니다. 이제 쥐의 장기를 적출할 수 있습니다. 뇌를 제거하려면 길로틴을 사용하여 머리를 분리함으로써 고정된 쥐의 해부를 시작하십시오.

다음으로, 목에서 코까지 피부를 따라 정중선 절개를 하고 가위로 두개골을 노출시킵니다. 두개골 기저부가 노출되도록 남은 목 근육을 잘라냅니다. 아이리스 가위의 날카로운 끝부분을 한쪽의 대공(foramen magnum)에 넣고, 두개골의 내면을 따라 가위를 조심스럽게 밀어 넣습니다.

다음으로 후두골 표면의 원위단까지 절개합니다. 반대편에도 동일하게 절개합니다. 그 후 론(theros)을 사용하여 소뇌 주변의 두개골을 제거합니다.

가위 끝을 두개골 내면을 따라 등쪽 원위 후방 모서리에서 원위 전두 능선까지 조심스럽게 밀어 넣습니다. 칼끝을 들어 올려 뇌가 손상되지 않도록 주의하십시오. 이 과정을 반대편에서도 반복하여 절개합니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 두개골의 등쪽 표면을 뇌에서 벗겨냅니다. 마찬가지로 핀셋을 사용하여 두개골의 측면을 다듬어 제거합니다. 이제 스패튤라를 사용하여 뇌의 배쪽 표면을 따라 후각구와 신경 연결 부위를 절단하고, 머리에서 뇌를 조심스럽게 분리합니다.

아이리스 가위(iris scissors)를 사용하여 뇌와 두개골을 연결하는 경막을 절단합니다. 뇌를 적출한 후, 뇌 부피의 최소 10배에 해당하는 고정액이 담긴 바이알에 넣습니다. 바이알을 4°C에서 24시간 동안 보관하십시오.

24시간 후, 뇌를 PBS로 3회 부드럽게 흔들어 세척합니다. 세척한 뇌는 PBS 또는 heis Hanks 용액에 보관할 수 있습니다. 소듐 아자이드(sodium azide)를 첨가하여 4°C에서 보관할 경우, 뇌를 3개월 동안 보관할 수 있습니다.

분절하지 않습니다. 숙련되면 전체 관류 과정은 5분에서 8분 사이에 완료될 수 있습니다.