Het algemene doel van deze procedure is om onze perfusiefixatietechniek te demonstreren, waarbij de nadruk ligt op het gebruik van fysiologische drukken om rattenhersenweefsel correct te conserveren voor immunohistochemische procedures. Eerst worden het gebruik en de opstelling van het perfusieapparaat gedemonstreerd. Vervolgens worden de benodigde instrumenten voor zowel de perfusiechirurgie als de verwijdering van de hersenen verzameld, en wordt het diep genarceerde dier in een ondiepe bak met gecrusht ijs geplaatst.

Er wordt een laterale incisie van vijf tot zes centimeter gemaakt door het integument en de buikwand, net onder de ribbenkast. Het hart wordt blootgelegd en het dier wordt geperfuseerd. De laatste stap is het verwijderen van de hersenen en deze in een flesje fixatiumiddel te plaatsen met een volume dat ten minste 10 keer groter is dan dat van de hersenen zelf.

Het algemene doel van deze procedure is om onze perfusie-fixatietechniek te demonstreren, waarbij de nadruk ligt op het gebruik van fysiologische druk om rattenhersenweefsel correct te preserveren voor immunohistochemie. We beginnen met het klaarmaken van de perfusie-opstelling. Dit zal ongeveer 10 minuten duren. Gebruik een spuit van 50 milliliter om de fixatielijn herhaaldelijk door te spoelen en te reinigen met buffer totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.

Voor het succes van een perfusie is het essentieel dat er geen luchtbellen in de leidingen aanwezig zijn. Dit wordt bereikt door de uitlaatklep in een bekerglas met buffer te plaatsen. Sluit nu de uitlaatklep.

Verwijder vervolgens de buis uit de spuit terwijl u deze samenknijpt, zodat er een druppel buffer aan het uiteinde blijft hangen. Plaats de gevulde buis, met de inlaat voor het fixatiemiddel, in een fles met 200 milliliters paraldehyde-fixatiemiddel per dier. Let er hierbij op dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd.

Draai de dop vast en zorg ervoor dat de afdichting goed aansluit. Als deze niet correct is geplaatst, zal de druk binnen het gesloten systeem niet behouden blijven. Plaats de fles in de perfusie-opstelling.

Stel de doorstroming in vanaf alleen de bufferlijn door de uitlaatpoort te sluiten en het buffervalve in dezelfde positie te draaien als het fixatievalve. Open de uitlaatpoort en spoel de bufferlijn door, zoals eerder is gedaan voor de fixatielijn. Zodra de lijn is doorgespoeld, plaatst u de slang in de bufferfles.

Test vervolgens het vermogen van het systeem om druk vast te houden. Door in de rubberen manometerbal te knijpen, zal er weerstand voelbaar zijn. Als laatste voorbereiding.

Vul de perfusienaald met buffer om de introductie van lucht te voorkomen. Het systeem is nu klaar voor perfusie. Nadat een mengsel van ketamine en xylazine is toegediend en het chirurgische vlak van anesthesie via de teenknijpmethode is gecontroleerd, wordt de volledig geanestheseerde rat op een ondiepe schaal met geplette ijsblokjes geplaatst.

Ga niet verder voordat het dier volledig is geanestheseerd. Begin de operatie met een laterale incisie van vijf tot zes centimeter door het integument en de buikwand, net onder de ribbenkast. Scheid de lever voorzichtig van het diafragma.

Maak een kleine incisie in het diafragma met de gebogen botte schaar. De positie en druk van uw vinger kunnen helpen bij het doorknippen van het diafragma. Zet de incisie in het diafragma voort over de gehele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte bloot te leggen.

Plaats gebogen botte scharen langs één zijde van de ribben, verplaats de longen voorzichtig en maak een snede door de borstkas tot aan het sleutelbeen. Maak vervolgens een soortgelijke snede aan de contralaterale zijde. Til nu het borstbeen op en trim voorzichtig al het weefsel dat het met het hart verbindt.

Klem de punt van het borstbeen vast met de hemostat en plaats de hemostat over de kop. De thorax moet worden opgetild, waardoor de grote vaten duidelijk zichtbaar worden. Maak met irisscharen een kleine incisie in het posterieure uiteinde van de linker ventrikel.

Voer een stompe perfusienaald van 15 gauge of een naald met een olijfvormige punt door het ingesneden ventrikel in de ascienden aorta. De punt moet zichtbaar zijn door de wand van de aorta en mag de aortaboog niet bereiken, waar de arteria brachialis en de arteria carotis uiteenlopen. Klem het hart met een hemostat om de naald te fixeren en lekkage te voorkomen.

Gebruik tot slot de irisschaar om een grote opening in het rechteratrium te maken. Let erop dat de aorta descendens niet beschadigd raakt. Op dit punt is het dier klaar om geperfundeerd te worden.

Koppel de perfusienaald in het rechteratrium aan de uitlaatpoort zonder luchtbellen te introduceren en open de uitlaatpoort. Pomp vervolgens snel en gelijkmatig de manometerebal op tot een druk van 80 millimeter kwik. Handhaaf deze druk gedurende de gehele periode van de bufferinfusie.

Start nu een timer. Pas de hoek van de naald aan tot de stroom het sterkst is, en schakel het buffervalve om zodra de buffer bijna op is. De vloeistof zal helder beginnen te lopen wanneer de lever is geperfuseerd.

Dit is een indicatie van een goede perfusie en het tijdstip waarop de lever klaart, moet zeer snel worden genoteerd. Na deze gebeurtenis zullen fixatiebevingen waarneembaar zijn. Geef dit aan als het tijdstip van de werkelijke fixatie. Om een constante stroomsnelheid te behouden, kan de druk geleidelijk worden verhoogd tot maximaal 130 millimeters kwik.

Zodra het fixatiemiddel bijna volledig is verbruikt, sluit u de uitlaatklep en noteert u het tijdstip. De rat moet nu stijf zijn. De organen van de rat kunnen nu worden geoogst. Om de hersenen te verwijderen, begint u de dissectie van de gefixeerde rat door de kop met een guillotine te verwijderen.

Maak vervolgens een midline-incisie langs het integument van de nek tot aan de neus en leg de schedel bloot met een schaar, oraal. Trim het resterende nekspierweefsel weg zodat de basis van de schedel zichtbaar is. Plaats het scherpe uiteinde van een irisschaar in het foramen magnum aan één zijde en schuif de schaar voorzichtig langs het binnenoppervlak van de schedel.

Maak vervolgens een incisie die doorloopt tot aan de distale rand van het posterieure schedeloppervlak. Maak een identieke incisie aan de contralaterale zijde. Gebruik daarna rongeurs om de schedel rondom het cerebellum te verwijderen.

Schuif de punt van de schaar voorzichtig langs het binnenoppervlak van de schedel, van de dorsale distale posterieure hoek naar de distale frontale rand. Voorkom beschadiging van de hersenen door de punt van het blad omhoog te tillen. Herhaal deze handeling aan de tegenovergestelde zijde.

Pel vervolgens met een pincet het dorsale oppervlak van de schedel van de hersenen af. Trim ook de zijkanten van de schedel weg met een pincet. Sever nu met een spatel de bulbi olfactorii en de zenuwverbindingen langs het ventrale oppervlak van de hersenen en scheid voorzichtig de hersenen van de kop.

Knip met een irisschaar alle dura door die de hersenen met de schedel verbindt. Zodra de hersenen zijn verwijderd, plaatst u deze in een vial met fixeer cairan met een volume dat ten minste 10 keer groter is dan het volume van de hersenen zelf. Bewaar de vial 24 uur lang bij vier graden Celsius.

Was na 24 uur de hersenen 3 keer met PBS door voorzichtig te walsen. De hersenen kunnen vervolgens worden bewaard in PBS of Hanks-gebalanceerde zoutoplossing. Met natriumazide kunnen de hersenen gedurende drie maanden worden bewaard bij vier graden Celsius.

Niet gesneden. Eenmaal beheerst, kan de volledige perfusie in vijf tot acht minuten worden voltooid.