O objetivo geral deste procedimento é demonstrar nossa técnica de fixação por perfusão, que enfatiza o uso de pressões fisiológicas para preservar adequadamente o tecido cerebral de rato para procedimentos de imunohistoquímica. Primeiramente, é demonstrado o uso e a montagem do aparelho de perfusão. Em seguida, são reunidas as ferramentas necessárias para realizar tanto a cirurgia de perfusão quanto a remoção do cérebro, e o animal profundamente anestesiado é posicionado numa bandeja rasa preenchida com gelo picado.

Uma incisão lateral de cinco a seis centímetros através do tegumento e da parede abdominal é feita logo abaixo da caixa torácica. O coração é exposto e o animal é perfundido. O passo final é remover o cérebro e colocá-lo em um frasco contendo fluido fixador com volume pelo menos dez vezes maior que o do próprio cérebro.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar nossa técnica de fixação por perfusão que enfatiza o uso de pressões fisiológicas para preservar adequadamente o tecido cerebral de rato para imunohistoquímica. Começaremos preparando o equipamento de perfusão. Isso levará cerca de 10 minutos. Usando uma seringa de 50 mililitros, enxágue e limpe repetidamente a linha de fixador com tampão até que todas as bolhas de ar sejam removidas.

É fundamental para o sucesso de uma perfusão não ter bolhas de ar em nenhuma das linhas. Isso é conseguido colocando a válvula de saída em um béquer cheio de tampão. Agora, feche a válvula de saída.

Em seguida, retire o tubo da seringa enquanto o comprime para que uma gota de tampão fique pendurada na extremidade. Coloque o tubo cheio, com a entrada do fixador, em um frasco contendo 200 mililitros de fixador de paraldeído por animal. Tendo o cuidado de não introduzir bolhas de ar.

Aperte a tampa, certificando-se de que o selo esteja adequadamente encaixado. Se não estiver bem encaixado, a pressão dentro do sistema fechado não será mantida. Coloque a garrafa no equipamento de perfusão.

Regule o fluxo apenas pela linha do tampão fechando a porta de saída e girando a válvula do tampão para a mesma posição da válvula do fixador. Abra a porta de saída e limpe a linha do tampão como feito anteriormente para a linha do fixador. Uma vez que a linha estiver limpa, posicione o tubo dentro do frasco do tampão.

Em seguida, teste a capacidade do sistema de manter a pressão. Ao comprimir a bomba de borracha do manômetro, haverá resistência. Como preparação final.

Encha a agulha de perfusão com tampão para evitar a introdução de ar. O sistema está agora pronto para a perfusão. Após administrar uma mistura de cetamina e xilazina sem verificação do plano cirúrgico de anestesia pelo método do aperto no dedo da pata, posicione a rata completamente anestesiada sobre uma bandeja rasa contendo gelo picado.

Não prossiga a menos que o animal esteja completamente anestesiado. Inicie a cirurgia com uma incisão lateral de cinco a seis centímetros através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Separe cuidadosamente o fígado do diafragma.

Faça uma pequena incisão no diafragma utilizando a tesoura curva romba. A posição e a pressão do seu dedo podem auxiliar no corte do diafragma. Continue a incisão no diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural.

Posicione a tesoura romba curva ao longo de um lado das costelas, deslocando cuidadosamente os pulmões, e faça um corte através da caixa torácica até a clavícula. Em seguida, realize um corte semelhante no lado contralateral. Agora, levante o esterno e retire cuidadosamente qualquer tecido que o conecte ao coração.

Prenda com uma pinça hemostática a ponta do esterno e coloque a pinça sobre a cabeça. O tórax deverá se abrir, proporcionando uma visão clara dos principais vasos. Com uma tesoura de íris, faça uma pequena incisão na extremidade posterior do ventrículo esquerdo.

Passe uma agulha de perfusão romba ou com ponta em oliva de 15 gauge através do ventrículo cortado e para dentro da aorta ascendente. A ponta deve ser visível através da parede da aorta e não deve alcançar o arco aórtico, onde as artérias braquiais e carótidas se dividem. Para fixar a agulha e evitar vazamentos, prenda o coração com uma pinça hemostática.

Finalmente, use a tesoura de íris para fazer uma grande abertura no átrio direito. Tenha cuidado para não danificar a aorta descendente. Neste ponto, o animal está pronto para ser perfundido.

Conecte a agulha de perfusão no átrio direito ao duto de saída sem introduzir bolhas de ar e abra o duto de saída. Em seguida, bombeie rapidamente e uniformemente a bolsa do manômetro até uma pressão de 80 milímetros de mercúrio. Mantenha essa pressão durante todo o período de infusão do tampão.

Agora inicie um cronômetro. Ajuste o ângulo da agulha para onde o fluxo for mais intenso, e quando o tampão estiver quase esgotado, troque a válvula do tampão. O fluido começará a correr limpo quando o fígado estiver perfundido.

Isso é uma indicação de uma boa perfusão e o momento de esvaziamento do fígado deve ser anotado muito rapidamente. Após esse evento, serão observados tremores de fixação. Indique isso como o momento da fixação verdadeira. Para manter uma taxa de fluxo constante, a pressão pode ser aumentada gradualmente até um máximo de 130 milímetros de mercúrio.

Quando o fixador estiver quase terminado, feche a válvula de saída e anote o horário. O rato deve estar agora rígido. Os órgãos do rato podem agora ser coletados. Para remover o cérebro, inicie a dissecação do rato fixado removendo a cabeça com uma guilhotina.

Em seguida, faça uma incisão mediana ao longo do tegumento desde o pescoço até o nariz e exponha o crânio com tesoura, orais. Retire o músculo remanescente do pescoço para que a base do crânio fique exposta. Coloque a ponta afiada de uma tesoura de íris no forame magno de um lado, deslizando cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio.

Em seguida, faça um corte que se estende até a borda distal da superfície posterior do crânio. Faça um corte idêntico no lado contralateral. Em seguida, use o theros para remover o crânio ao redor do cerebelo.

Deslize cuidadosamente a ponta da tesoura ao longo da superfície interna do crânio, desde o canto dorsal distal posterior até a borda frontal distal. Evite danificar o cérebro levantando a ponta da lâmina. Durante esse processo, repita o procedimento, fazendo o corte no lado oposto.

Em seguida, utilizando pinças, retire a superfície dorsal do crânio do cérebro. Corte as laterais do crânio também com pinças. Agora, usando uma espátula, seccione os bulbos olfativos e as conexões nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro e delicadamente solte o cérebro da cabeça.

Usando tesoura de íris, corte qualquer dura que conecte o cérebro ao crânio. Após a remoção do cérebro, coloque-o em um frasco com fixador que tenha um volume de pelo menos 10 vezes o volume do cérebro. Armazene o frasco a quatro graus Celsius por 24 horas.

Após 24 horas, lave o cérebro com PBS 3 vezes com movimentos suaves de rotação. O cérebro pode então ser armazenado em PBS ou meio de Hanks. Com azida de sódio a quatro graus Celsius, os cérebros podem ser armazenados por até três meses.

Desseccionado. Uma vez dominado, toda a perfusão pode ser concluída entre cinco e oito minutos.