Общая цель данной процедуры — продемонстрировать нашу методику перфузионной фиксации, в которой особое внимание уделяется использованию физиологического давления для надлежащего сохранения тканей мозга крысы для последующего проведения иммуногистохимических исследований. Сначала демонстрируется использование и настройка аппарата для перфузии. Затем подготавливаются инструменты, необходимые для проведения как самой операции по перфузии, так и извлечения мозга, после чего глубоко анестезированное животное помещают в неглубокий лоток с дробленым льдом.
Сразу под реберной дугой делают латеральный разрез кожных покровов и брюшной стенки длиной от пяти до шести сантиметров. После обнажения сердца проводят перфузию животного. Заключительным этапом является извлечение мозга и его помещение в флакон с фиксирующей жидкостью, объем которой должен быть как минимум в 10 раз превышать объем самого мозга.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать нашу методику перфузионной фиксации, основанную на использовании физиологического давления для надлежащего сохранения тканей головного мозга крысы для иммуногистохимического анализа. Мы начнем с подготовки установки для перфузии. Это займет около 10 минут. С помощью шприца объемом 50 мл многократно промойте линию подачи фиксатора буфером до полного удаления всех пузырьков воздуха.
Для успешного проведения перфузии крайне важно отсутствие пузырьков воздуха в любой из линий. Это достигается путем помещения выпускного клапана в стакан с буфером. Теперь закройте выпускной клапан.
Затем извлеките трубку из шприца, сжимая его так, чтобы на конце трубки осталась капля буфера. Поместите заполненную трубку (входной конец фиксатора) в флакон с 200 миллилитрами паральдегидного фиксатора на одно животное, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха.
Плотно закройте крышку, убедившись, что уплотнение установлено правильно. Если уплотнение установлено неверно, давление внутри закрытой системы не сохранится. Поместите флакон в установку для перфузии.
Установите поток только из линии с буфером, закрыв выпускной порт и повернув клапан буфера в то же положение, что и клапан фиксатора. Откройте выпускной порт и продуйте линию с буфером, как это было сделано ранее для линии с фиксатором. После продувки линии поместите трубку в бутыль с буфером.
Затем проверьте способность системы поддерживать давление. При сжатии резиновой груши манометра должно возникнуть сопротивление. В качестве заключительного этапа подготовки.
Заполните перфузионную иглу буфером, чтобы предотвратить попадание воздуха. Теперь система готова к перфузии. После введения смеси кетамина и ксилазина с проверкой глубины хирургического наркоза методом щипка за пальцы лапы, поместите полностью анестезированную крысу на плоский лоток с дробленым льдом.
Не приступайте к процедуре, пока животное не будет полностью анестезировано. Начните операцию с латерального разреза длиной пять-шесть сантиметров через кожный покров и брюшную стенку непосредственно под грудной клеткой. Осторожно отделите печень от диафрагмы.
Сделайте небольшой разрез диафрагмы с помощью изогнутых тупоконечных ножниц. Положение и нажим пальца могут помочь в разрезании диафрагмы. Продолжайте рассекать диафрагму по всей длине грудной клетки, чтобы обнажить плевральную полость.
Поместите изогнутые тупоконечные ножницы вдоль одного края ребер, осторожно отодвинув легкие, и сделайте разрез через грудную клетку до ключицы. Затем сделайте аналогичный разрез на противоположной стороне. Теперь приподнимите грудину и осторожно удалите все ткани, соединяющие ее с сердцем.
Зажмите конец грудины гемостатом и отведите гемостат в сторону головы. Грудина должна приподняться, обеспечивая четкий обзор основных сосудов. С помощью ирисовых ножниц сделайте небольшой надрез на заднем конце левого желудочка.
Проведите перфузионную иглу с тупым или оливковым наконечником калибра 15 через разрез желудочка в восходящую аорту. Кончик иглы должен быть виден через стенку аорты и не должен достигать дуги аорты в месте отхождения плечевых и сонных артерий. Чтобы зафиксировать иглу и предотвратить утечку, зажмите сердце гемостатом.
Наконец, с помощью ирисных ножниц сделайте большое отверстие в правом предсердии. Будьте осторожны, чтобы не повредить нисходящую аорту. Теперь животное готово к перфузии.
Присоедините перфузионную иглу в правом предсердии к выходному порту, не допуская попадания пузырьков воздуха, и откройте выходной порт. Затем быстро и равномерно сожмите грушу манометра до достижения давления 80 мм рту. Поддерживайте это давление на протяжении всего периода введения буфера.
Теперь запустите таймер. Отрегулируйте угол наклона иглы так, чтобы поток был максимально сильным, и, когда буфер почти закончится, переключите клапан подачи буфера. Жидкость станет прозрачной, когда печень будет перфузирована.
Это указывает на хорошую перфузию; время очищения печени должно быть зафиксировано максимально точно. После этого события будут наблюдаться треморы фиксации. Отметьте этот момент как время истинной фиксации. Для поддержания стабильной скорости потока давление можно постепенно увеличить до максимума в 130 мм рт ст.
Когда фиксатор будет почти израсходован, закройте выпускной клапан и зафиксируйте время. Тело крысы теперь должно быть ригидным. Теперь можно приступить к извлечению органов крысы. Для извлечения головного мозга начните диссекцию фиксированной крысы с отделения головы с помощью гильотины.
Затем сделайте срединный разрез кожных покровов от шеи до носа и с помощью ножниц обнажите череп. Срежьте оставшиеся мышцы шеи так, чтобы стало видно основание черепа. Введите острый конец ирисных ножниц в foramen magnum с одной стороны, осторожно ведя ножницами вдоль внутренней поверхности черепа.
Затем сделайте разрез, extending до дистального края задней поверхности черепа. Сделайте аналогичный разрез на противоположной стороне. Затем с помощью щипцов-ронжеров удалите кости черепа вокруг мозжечка.
Осторожно проведите кончиком ножниц вдоль внутренней поверхности черепа от дорсального дистального заднего угла к дистальному фронтальному выступу. Избегайте повреждения мозга, не приподнимая кончик лезвия. После этого повторите разрез с противоположной стороны.
Затем с помощью пинцета отделите дорсальную поверхность черепа от мозга. Также с помощью пинцета удалите боковые части черепа. Теперь с помощью шпателя перережьте обонятельные луковицы и нервные связи вдоль вентральной поверхности мозга и осторожно извлеките мозг из головы.
С помощью ирисных ножниц перережьте любую твердую мозговую оболочку, соединяющую мозг с черепом. После извлечения мозга поместите его в флакон с фиксатором, объем которого минимум в 10 раз превышает объем самого мозга. Храните флакон при температуре четырех градусов Цельсия в течение 24 часов.
Через 24 часа промойте мозг в PBS 3 раза, осторожно вращая контейнер. После этого мозг можно хранить в PBS или растворе Хенкса. При добавлении азида натрия мозг можно хранить при температуре четырех градусов Цельсия в течение трех месяцев.
Без секционирования. После освоения методики вся процедура перфузии может быть выполнена в течение от пяти до восьми минут.