本実験の全体的な目的は、拡張型心筋症またはその他の自己免疫的背景を持つ心疾患患者の血漿中から、心向性抗体を検出することです。これは、まず患者の血漿をanti IgG spherosカラムでミニ免疫吸着させ、第2段階として免疫グロブリンGを精製することによって達成されます。このバイオアッセイの細胞基盤として、成体Wistarラットから心室心筋細胞を単離します。
次に、心筋細胞をチャンバーのカバーガラスに接着させ、収縮時の細胞内カルシウム一過性変化を観察できるようにURA 2:00 AMで染色し、その後、患者のIgGを添加して心筋細胞の収縮能への影響を検証します。この結果から、単離した心筋細胞における収縮能とカルシウム一過性変化の変化に基づき、患者のIgGにトロピック抗体が含まれているかどうかが判定されます。抗体検出のための標準的な免疫測定法などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、特定の抗原に依存せず、刺激性抗体と遮断性抗体を区別できることです。
この手順のデモンストレーションは、当研究室による技術支援を受けて行われます。この手順を開始するには、空のEconoPakカラムに、患者のEDTAプラズマ2 mLあたり3 mLのanti-IgG sphereを充填して、ミニ免疫吸収カラムを準備します。次に、anti-IgG sphereの上にフィルターを配置します。
カラムの下端を切り開き、フィルターを押し込んで、流速が約1秒に1滴になるように調整します。次に、0.9%塩化ナトリウム溶液を1回分の血漿量で3回、カラムに流して洗浄します。血漿がanti IgG Spherosに完全に浸漬されたら、同量の0.9%塩化ナトリウムで洗浄します。続いて、pH 2.8の0.2 Mグリシン塩酸塩を1回分の血漿量でカラムに注入し、粒子に浸漬させます。
次に、同量のグリシン塩酸塩をカラムに加えます。流出液を15 mLチューブに回収し、pH 8.0の0.5 M Tris-HClを用いてpHを7.3に調整し、カラムを再生させます。最後に0.9%塩化ナトリウムを2倍量で洗浄した後、グリシン塩酸塩を3プラズマ量で洗浄します。
このカラムは、心筋細胞に使用する次の血漿サンプルのために再利用可能です。回収したIgG画分は、まず分子量カットオフが100 kilodaltonsのセルロースエステル透析膜チューブにIgG画分を満たし、実験用バッファー（EB）に対して透析する必要があります。次に、チューブを1 literのEBに入れ、4 °Cでマグネチックスターラーを用いてゆっくりと攪拌します。8時間後、透析チューブを3 litersの新しいEBに移し、4 °Cでさらに20時間透析を行います。
サンプルをウォーターバスを用いて57 °Cで30分間煮沸します。補体因子を不活性化させるため、総IgG濃度を測定し、そ