Name: Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Leer cardiotrope antilichamen detecteren in patiëntenplasma met gedilateerde cardiomyopathie met behulp van geïsoleerde rat cardiomyocyten. Deze methode analyseert het effect van IgG op celcontractiliteit en calciumtransiënten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Sonderforschungsbereich TransRegio 19 (SFB/TR19, C2) van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), het federale ministerie van Economie en Technologie project ZIM-KF 2727801MD0 en het Centrum voor Innovatie Competence - humorale immuunresponsen in Hart-en vaatziekten ( ZIK-HIKE, BMBF FKZ 03Z2CN12) van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek, Duitsland. Huisvesting en experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Vereniging voor Proefdierkunde (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) en de Federatie van Europese Laboratory Animal Science Association (FELASA).

1. IgG Isolatie uit monsters van patiënten <ol><li> Bereid mini-immunoadsorptie kolommen door het invullen van 3 ml anti-IgG sepharose per 2 ml patiënt EDTA plasma in een lege Econo Pac kolom. IgG isolatie vereist ten minste 2 ml van de patiënt plasma. </li><li> Plaats een filter bovenop de anti-IgG sepharose, opengesneden het laagste punt van de kolom en druk het een debiet van ongeveer 1 druppel / sec bereiken. Laat de preservatievloeistof opraken van de kolom. </li><li> Was de kolom met 3 volumes 0,9% NaCl per volume plasma. </li><li> Pipetteer de plasma op de kolom. Wanneer het plasma volledig is ondergedompeld in de anti-IgG sepharose, wassen met hetzelfde volume 0.9% NaCl. </li><li> Pipetteer een plasmavolume van 0,2 M glycine HCl, pH 2,8 op de kolom en laat onderdompelen in de sepharose. Voeg een volume van glycine HCl op de kolom. Verzamel de stroming door in een 15 ml buis en breng de pH op 7,3 met 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0. </li><li> Om de kolom te regenereren, Wassen met 3 plasma volumes glycine HCl. Na een laatste wassing met 2 volumes 0,9% NaCl, kan de kolom worden gebruikt voor de volgende plasmamonster. Als alternatief kan de kolom worden gevuld met preservatievloeistof en bij 4 - 8 ° C tot 4 weken. </li><li> Voor gebruik op cardiomyocyten, de verzameld IgG fractie wordt gedialyseerd tegen experimentele buffer (EB). Voor de bereiding van EB, voeg 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,2 mM KH 2PO 4, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES en 20 mM glucose tot 1 L gedistilleerd water op een magnetische roerder en de pH tot 7.3. </li><li> Vul de IgG fractie naar een cellulose ester dialysemembraan buis met een molecuulgewicht cut off van 100 kDa. Plaats de buis in 1 L EB en roer langzaam met een magnetische roerder bij 4 ° C. Na 8 uur en spoel de dialysebuis in 3 L verse EB en dialyseer nog 20 uur bij 4 ° C. </li><li> Na dialyse Verwarm het monster gedurende 30 minuten bij 57 ° C in een waterbad tot inactivate aanvulling factoren. Bepaal totale IgG-concentratie en de voorbereiding van monsters met 330 mg IgG per stuk. Bij het toevoegen van het monster voor de meting cardiomyocyten (stap 4.3), vul de aliquots van 1 ml met EB. Onverdunde aliquots kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik. </li></ol> 2. Isolatie van cardiomyocyten van de rat <ol><li> Voor de bereiding van Ca2 +-vrije buffer isolatie (IB), voeg 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2PO 4, 20 mM HEPES en 11 mM glucose tot 1 L gedestilleerd water met een magnetische roerder. Breng de pH op 7,4 op kamertemperatuur en filtreer door een 0,2 um flesje bovenste filter voor sterilisatie. </li><li> Vul 80 ml IB in het bovenste reservoir van een thermostaat Langendorff perfusiesysteem. Pas thermostaatinstellingen een buffer van 37 ° C behouden en beluchten buffer met 95% O2 / 5% CO2 gedurende 30 minuten. </li><li> Weeg ongeveer 10.000 - 12.000 U van collagenase type II, 175 mg BSA vrije vetzuren en opgelost in 20 ml IB bevattende 22,5 ul van een 100 mM CaCl2 voorraadoplossing. Controleer de pH van de isolatie buffer in het bovenste reservoir en pas indien nodig. </li><li> Verdoven een Wistar rat van 175 - 200 g met 375 ug / kg lichaamsgewicht thiopental. Voeg 2500 IU heparine thiopental oplossing. Na thoracotomie, accijnzen het hart voorzichtig met een intacte aortaboog en breng deze over in ijskoud 0,9% NaCl. Reinig het hart van bloed en het omringende weefsel en overdracht naar vers 0,9% NaCl. Bloot de aorta, opent de stroming van het verloopstuk Langendorff systeem een ​​dalende snelheid 2-3/sec verkrijgen en het hart hechten aan de canule. </li><li> Perfuseren het hart tot 3 minuten met een stroomsnelheid van 1 druppel / sec te wassen resterende bloed. Start om het IB in het Langendorff systeem circuleren. Verwijder 20 ml buffer van de bovenste reservoir, vul de collagenase oplossing en vul zo veel buffer als nodig is om 80 ml te bereiken. Circulate de c<html> ollagenase oplossing voor 27 min. Debiet moet periodiek worden gecontroleerd en gehandhaafd op 1 druppel / sec met behulp van de flow reducer. </li><li> Maak het hart van de canule, vrij van atria en de aorta en hak ze in kleine stukjes. Laat de collagenase oplossing te lopen in het onderste reservoir, het volume maximaal 40 ml en na de gehakte ventrikels verteren gedurende 10 - 15 min onder continue beluchting met 95% O2 / 5% CO 2. Daarna filter de celsuspensie door een 200 pm maaswijdte gaas in een 50 ml buis. </li><li> Herstel de Ca 2 + inhoud van de cellen in 3 stappen: centrifugeer de celsuspensie bij 43 x g 2 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer cellen in 10 ml IB met 200 pM CaCl2. Centrifugeer opnieuw cellen en resuspendeer in 10 ml IB met 500 pM CaCl2. Na een laatste centrifugatie cardiomyocyten in steriel gefiltreerd EB (zie 1.8) mengen tot een dichtheid van 50.000 cellen / ml. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Fura-2 Kleuren van cardiomyocyten <ol><li> Coat een 4 goed chambered dekglaasje met 10 ug laminine per putje en wacht tot deze volledig is gedroogd. </li><li> Vul 1 ml van de cardiomyocyt suspensie in elk putje met behulp van een micropipet met een cut tip. Laat de cellen hechten gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun 10 ul van 1 mg / ml Fura-2 AM voorraadoplossing in 5 ml EB. Houd de kleuroplossing in het donker. </li><li> Opstijgen buffer en ongebonden cellen van het dekglaasje en pipet 0,5 ml van de kleuroplossing in elk putje. Incubeer de cellen gedurende 10 min onder matig schudden. Vervolgens neemt u de kleuroplossing, een keer wassen cellen met 1 ml EB en uiteindelijk 0,5 ml EB te vullen in elk putje. Vermijd direct licht tijdens het beitsen en altijd de gekleurde cellen te houden in het donker. </li></ol> 4. Opname van Cell Verkorting en Ca 2 + Transients <ol><li> Plaats de chambered dekglaasje op een inverse fluorescentie microscope verbonden met een myocyte calcium en contractiliteit opnamesysteem. Plaats een op maat gemaakte elektrode met een-en uitstroom buis in het eerste putje. Superfuse cardiomyocyten met 1 ml / min EB en start de elektrische stimulatie (20 V, 1 Hz, 5 msec duur). Laat de cellen zich aanpassen aan de stimulering ongeveer 2 minuten. </li><li> Kies een intacte staafvormige cardiomyocyten met duidelijke strepen en constante contractie. Plaats de cel in het midden van het gezichtsveld van de camera en open kanaal. Horizontaal Oriënteer de cel binnen het video-oppervlak door het draaien van de cel framing adapter en het verplaatsen van de microscoop podium. </li><li> Stel de randen te detecteren bedieningselementen van de video gebied (figuur 2), opent u de fluorescerende kanaal en opnemen 10 tot 15 contracties om de eerste cel verkorten en Ca 2 + van voorbijgaande aard te verkrijgen. </li><li> Sluit de microscoop licht kanaal om te voorkomen dat het bleken van de fluorescentie vlek. Schakel de stroom door van EB tot het monsterbypass met een 3-weg klep en superfuse cardiomyocyten met 1 ml van de patiënt IgG. Stop de pomp net voor lucht de put bereikt. </li><li> Open het licht kanaal en opnemen van een 10 tot 15 contracties om de acute cel respons te verkrijgen. De opname te pauzeren en weer te sluiten het licht kanaal. Herhaal de opname na 2 en 5 minuten. </li><li> Neem de elektrode van de put. Reinig de buizen met EB en ga verder met de volgende put van de chambered dekglaasje. </li><li> Analyseer de cel verkorten en Ca 2 + voorbijgaande aard, met de IonWizard software met behulp van de &quot;Edge-Length/Length&quot; en de &quot;fura 2-Numeriek afgetrokken / Ratio&quot; venster, respectievelijk. De procentuele verandering van de initiële cel bakvet en Ca 2 + transient van de piekhoogte verwezen naar de basislijn (bl% piek h) voor de acute, de 2 min 5 min en de reactie. </li></ol>

<ol><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18(2011).</li>
<li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462(2008).</li>
<li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+J%22%5BJournal%5D)">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602(2009).</li>
<li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy%3A+Three-month+results+from+a+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590(2000).</li>
<li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy%3A+results+from+protein+A+immunoadsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729(2005).</li>
<li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423(2007).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649(1999).</li>
<li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis%3A+further+evidence+for+a+multigene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296(1987).</li>
<li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194(1990).</li>
<li>Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiper%2C+HM+%22Cell+Culture+Techniques+in+Heart+and+Vessel+Research%22">Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).</li>
<li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179(1999).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440(1985).</li>
<li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760(1994).</li>
<li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209(2002).</li>
<li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses%3A+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854(2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De gepresenteerde methode biedt een geschikte manier om functioneel effectieve cardiale autoantilichamen te sporen bij patiënten met DCM van onduidelijke herkomst. In vergelijking met andere methoden, de detectie van functionele actieve antilichamen tegen de β1-adrenoceptor bijvoorbeeld door het effect op cAMP niveaus 6, onze methode is onafhankelijk van een specifiek epitoop. Natuurlijk zijn er andere epitoop onafhankelijke proeven in de literatuur beschreven, namelijk het tellen van de gew...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Immunosorba preservatievloeistof </td><td> Fresenius Medical Care </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase type 2 </td><td> Cell System </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, vrije vetzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0888 </td><td> 1 mg / ml in DMSO </td></tr><tr><td> Econo Pac chromatografiekolommen </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech cellulose-ester Dialyse Membrane </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 goed Chambered coverglass </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Myocyten Calcium en contractiliteit opnamesysteem </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6,0 ​​analysesoftware </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

meting van antilichaam effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) is een van de belangrijkste oorzaken van hartfalen bij jongere volwassenen 1. Hoewel genetische aanleg en blootstelling aan toxische stoffen bekende oorzaken van deze ziekte bij ongeveer eenderde van de patiënten, de oorsprong van DCM grotendeels onduidelijk. In een groot aantal van deze patiënten hebben autoantilichamen tegen cardiale epitopen gedetecteerd en wordt vermoed een centrale rol spelen bij de ontwikkeling en progressie van de ziekte 2,3. Het belang van cardiale autoantilichamen wordt onderstreept door een hemodynamische verbetering waargenomen met DCM patiënten na verwijdering van auto-antistoffen door immunoadsorptie 3-5. Een verscheidenheid van specifieke antigenen zijn reeds geïdentificeerd 2,3 en antilichamen tegen deze targets worden gedetecteerd door immunoassays. Maar deze assays geen onderscheid maken tussen stimuleren (en dus functioneel effectief) en blokkeren autoantilichamen. Er steeds evidence dat dit onderscheid is cruciaal 6,7. Ook kan worden uitgegaan dat de targets voor een aantal cardiotropic antilichamen nog niet geïdentificeerd zijn en dus niet worden gedetecteerd door immunoassays. Daarom hebben we een methode voor de detectie van antilichamen functioneel actief cardiotropic, onafhankelijk van hun antigen. De achtergrond van de werkwijze is de hoge homologie meestal waargenomen voor functionele regio van cardiale eiwitten in zoogdieren tussen 8,9. Dit suggereert dat cardiale antilichamen gericht tegen humane antigenen zullen kruisreageren met niet-menselijke doelwitcellen die testen van IgG kunnen uit DCM patiënten volwassen cardiomyocyten van de rat. De methode bestaat uit drie stappen: eerst IgG geïsoleerd uit patiënten met plasma sepharose gekoppelde anti-IgG antilichamen verkregen uit immunoadsorptie kolom (PlasmaSelect, Teterow, Duitsland). Tweede volwassen hartspiercellen worden geïsoleerd door collagenase perfusie in een Langendorff perfusie inrichting met apROTOCOL gewijzigd ten opzichte van eerdere werken 10,11. De verkregen hartspiercellen zijn aan laminine beklede chambered coverglasses en gekleurd met Fura-2, een calcium-selectieve fluorescerende kleurstof die gemakkelijk kunnen worden gebracht in de cel om intracellulaire calcium nemen (Ca 2 +) inhoud 12. In de laatste stap, het effect van IgG patiënt op de cel verkorten en Ca 2 + transiënten van gebied gestimuleerde cardiomyocyten wordt online gevolgd met een commerciële myocyte calcium en contractiliteit controlesysteem (IonOptix, Milton, MA, USA) aan een standaard inverse fluorescent microscoop.

Twee voorbeelden voor het meten van cellulaire inotropie in veld gestimuleerde volwassen hartspiercellen (figuur 2) met een myocyte Ca 2 + en contractiliteit registratiesysteem worden hieronder gegeven. Figuur 3 geeft een indruk van een controlemeting, terwijl in figuur 4 de invloed van antilichamen cardiodepressieve van een patiënt met DCM getoond. In beide voorbeelden initiële cel bakvet en Ca 2 + transient tijdens su...

De onderhavige methode biedt een manier om functioneel effectieve cardiotropic auto-antilichamen te detecteren in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie, ongeacht de specifieke antigen, door analyse van het effect van geïsoleerde patiënt immunoglobuline op cellulaire verkorten en intracellulair calcium transiënten in geïsoleerde cardiomyocyten van de rat.

Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Dilate cardiomyopathie (DCM) is een van de belangrijkste oorzaken van hartfalen bij jongvolwassenen1. Hoewel genetische aanleg en blootstelling aan toxische ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van cardiotrope antilichamen in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie of andere hartaandoeningen met een auto-immuunachtergrond. Dit wordt bereikt door een initiële mini-immunoabsorptie van patiëntenplasma op anti-IgG spheros-kolommen om in een tweede stap immunoglobuline G te zuiveren. Ventriculaire cardiomyocyten worden geïsoleerd uit volwassen Wistar-ratten, wat de cellulaire basis vormt voor deze bioassay.Vervolgens krijgen de cardiomyocyten de tijd om aan de dekglasjes van de kamer te hechten en worden ze gekleurd met URA 2:00 AM om de observatie van intracellulaire calciumtransiënten tijdens contracties mogelijk te maken, waarna het IgG van de patiënt wordt getest om het effect op de contractiliteit van de cardiomyocyten te observeren. De resultaten tonen aan of het IgG van een patiënt tropische antilichamen bevat op basis van de veranderingen in contractiliteit en calciumtransiënten in de geïsoleerde cardiomyocyten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard immunoassays voor de detectie van antilichamen, is dat deze onafhankelijk is van

measurement-antibody-effects-on-cellular-function-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

Dit protocol is bedoeld om stapsgewijze de techniek van extractie en beoordeling van de hartfunctie te beschrijven met behulp van gevilde cardiomyocyten. Deze methode maakt het mogelijk om de myofilamentfunctie te meten en te acuut temodificeren met kleine bevroren biopsieën die kunnen worden verzameld vanaf verschillende hartlocaties, van muizen tot mannen.

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

Hier rapporteren we een protocol voor de kwantificering en differentiatie van myocardiale B-lymfocyten op basis van hun locatie in de intravasculaire of endotheelruimte met behulp van flowcytometrie.

FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

Dit protocol beschrijft hoe contractiliteit in volwassen menselijke primaire cardiomyocyten van donorharten kan worden gemeten met het MyoBLAZER-systeem, een betrouwbaar platform voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in contractiliteit tijdens preklinische ontwikkeling.

Meting van hartcontractiliteit in geïsoleerde volwassen menselijke primaire cardiomyocyten

We introduceren een benadering van de cytosolische Ca...

Meting van cytosolische Ca 2 + In geïsoleerde contractiele lymphatische

Leer cardiotrope antilichamen detecteren in patiëntenplasma met gedilateerde cardiomyopathie met behulp van geïsoleerde rat cardiomyocyten. Deze methode analyseert het effect van IgG op celcontractiliteit en calciumtransiënten.