本实验的总体目标是通过高通量 PCR 技术在血链球菌中实现全基因组范围的单基因敲除。该目标首先通过高通量 PCR 扩增获得三个扩增片段来实现，包括抗生素抗性基因以及目的基因的上游和下游 DNA 序列。第二步是利用上述三个 PCR 扩增片段作为模板，获得线性重组 PCR 扩增产物。
接下来，制备感受态的 s sanguine 细胞。最后一步是将线性重组的 PCR 扩增片段转化入感受态的 s sanguineous 细胞中。最终通过菌落 A 的 PCR 扩增和 DNA 测序来验证正确的突变体。
与自杀质粒敲除等传统方法相比，该技术的主要优势在于能够直接通过高通量方法创建全基因组范围的缺失突变体。PCR 引物可根据书面实验方案中所述方法，利用基于缓症链球菌 SK36 基因组序列的内部脚本进行设计和合成。针对目标基因上游一千碱基序列、APH(3')-IIIa 基因（编码卡那霉素抗性蛋白）以及目标基因下游一千碱基序列，分别设计了三组引物用于扩增。
基因特异性引物。R1 和 F3 根据目标基因的 5' 端和 3' 端序列设计，用于高通量扩增目标 s sanguine 基因上游或下游 1 千碱基的区域。首先在冰上，于 15 毫升锥形管中配制 PCR 混合液。
参见文本，将含有基因组DNA的PCR反应混合物23微升使用多通道移液器加入至96孔PCR板的每个孔中。针对目的基因的上游序列，使用多通道移液器将10微摩尔工作浓度的引物板中的F1和R1引物各1微升分别加入PCR板中。同样地，使用F3和R3引物对目的基因的下游序列进行扩增。密封PCR板，并在94°C下预变性1分钟，随后进行30个循环：94°C变性30秒。
54摄氏度下30秒，68摄氏度下1.5分钟。扩增完成后，制备含适量溴化物的1%琼脂糖凝胶，凝胶需具有48孔，适用于多通道移液器加样。取4微升PCR产物与1微升5×DNA上样缓冲液混合。
在96孔板上，使用10微升多通道移液器将样品加入琼脂糖凝胶中。以135伏电压电泳运行30分钟。在UVP凝胶成像与分析系统下观察凝胶中的条带。
根据生产商提供的说明，使用纯链96 PCR纯化试剂盒通过离心法纯化PCR产物，以洗脱DNA。向结合板的每个孔中加入40微升无菌双蒸水。随机选取板上若干纯化后的扩增子，检测DNA浓度。
使用 NanoDrop 分光光度计，将板上扩增产物的浓度调整至约 10 纳克每微升。接着，使用 eco R one 酶切含有卡那霉素抗性基因 gisette 的质粒，使其可作为 PCR 模板。使用 kayak quick PCR 纯化试剂盒纯化酶切后的质粒，并将线性化质粒 DNA 的终浓度调整至 10 纳克每微升。
按照书面实验步骤中列出的 F two 和 R two 引物，配制 25 微升的 PCR 反应体系，用于卡那霉素抗性盒片段的扩增。结合本视频，按此处指示进行 PCR 扩增。