El objetivo general de este procedimiento es realizar deleciones genómicas a nivel de un solo gen en Streptococcus sanguinis mediante PCR de alto rendimiento. Esto se logra primero obteniendo tres amplicones mediante amplificación por PCR de alto rendimiento, incluyendo el gen de resistencia a antibióticos, así como las secuencias de ADN upstream y downstream del gen diana. El segundo paso consiste en obtener el amplicón recombinante lineal por PCR utilizando tres amplicones de PCR como plantillas.
A continuación, se preparan las células competentes de s sanguineus. El paso final consiste en transformar el amplicón recombinante lineal de PCR en células competentes de s sanguineus. Finalmente, se utiliza la amplificación por PCR del gen colon A y la secuenciación de ADN para verificar los mutantes correctos.
La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos agotados como el knockout con plásmido suicida es que este método puede generar directamente un mutante con deleción a nivel del genoma mediante alta productividad. Los cebadores para PCR pueden diseñarse y sintetizarse según se describe en el protocolo escrito, utilizando secuencias internas basadas en la secuencia del g