המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע מחיקות של גנים בודדים ברחבי הגנום ב-streptococcus sanguine באמצעות PCR בתפוקה גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת שלושה אמפליקונים באמצעות הגברה ב-PCR בתפוקה גבוהה, הכוללים את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה, וכן את רצפי ה-DNA שמעלה ושמטה לגן המטרה. השלב השני הוא השגת אמפליקון PCR רקומביננטי ליניארי תוך שימוש בשלושת אמפליקוני ה-PCR כתבניות.
בשלב הבא, מכינים את תאי ה-s sanguine המסוגלים. השלב האחרון הוא טרנספורמציה של האמפליקון הליניארי הרקומביננטי מ-PCR אל תוך תאי s sanguine מסוגלים. לבסוף, משתמשים בהגברה באמצעות PCR ובריצוף DNA כדי לאמת את המוטנטים הנכונים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות ומגבילות, כגון השבתה באמצעות פלסמיד התאבדות (suicide plasmid knockout), הוא ששיטה זו מאפשרת ליצור מוטנטים עם מחיקה ברחב הגנום באופן ישיר תוך שימוש בסריקה רב-ערוצית (high throughput). ניתן לתכנן ולסנתז פריימרים ל-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, באמצעות סקריפטים פנימיים המבוססים על רצף הגנום של streptococcus sanguineous SK 36. תוכננו שלושה סטים של פריימרים להגברה של רצף של 1 kb במעלה הזרם (upstream) של הגן המטרה, הקידוד של חלבון עמיד לקנמיצין (kanamycin resistance protein) של הגן A PHA three, ורצף של 1 kb במורד הזרם (downstream) של הגן המטרה.
פריימרים ספציפיים