本手順の全体的な目的は、ハイスループットPCRを用いて、streptococcus sanguineにおいてゲノムワイドな単一遺伝子欠損を作成することです。これは、まずハイスループットPCR増幅により、抗生物質耐性遺伝子、および標的遺伝者の上流および下流のDNA配列を含む3つのアンプリコンを取得することで達成されます。第2のステップでは、これら3つのPCRアンプリコンをテンプレートとして用いて、線状の組換えPCRアンプリコンを取得します。

次に、コンピテントs sanguine細胞を調製します。最終ステップは、線状の組換えPCRアンプリコンをコンピテントs sanguine細胞に形質転換することです。最終的に、コロニーPCR増幅とDNAシーケンシングを用いて、正しい変異体であることを確認します。

自殺プラスミドによるノックアウトなどの既存の他手法に対する本手法の主な利点は、ハイスループットを用いてゲノムワイドな欠損変異体を直接的に作製できることです。PCRプライマーは、streptococcus sanguineous SK 36のゲノム配列に基づいた社内スクリプトを用い、書面プロトコルに従って設計および合成することが可能です。標的遺伝子の1 kb上流配列、A PHA 3 遺伝子のENCコード領域、カナマイシン耐性タンパク質、および標的遺伝子の1 kb下流配列を増幅するために、3セットのプライマーを設計しました。

遺伝子特異的プライマー。R1およびF3は、標的遺伝子の5'端および3'端の配列に基づいて設計されており、標的とするs sanguine遺伝子の1 kb上流または下流領域を高スループットで増幅します。まず、15 mLコニカルチューブ内でPCRカクテル混合物を氷上で調製します。

s sanguineousゲノムDNAを含むPCR混合液の組成については本文を参照してください。マルチチャンネルピペットを用いて、この混合液23 µLを96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注します。標的遺伝子のアップストリーム配列について、10 µMのワーキングプライマープレートからF1およびR1をそれぞれ1 µLずつマルチチャンネルピペットでPCRプレートに分注します。同様に、標的遺伝子のダウンストリーム配列を増幅させるため、F3およびR3プライマーについても同様の操作を行います。PCRプレートを封印し、94 °Cで1分間加熱した後、94 °Cで30秒間のサイクルを30回繰り返して増幅を行います。

54 °Cで30秒間、および68 °Cで1.5分間保持します。増幅後、マルチチャンネルピペットでのロードに適した48ウェルを持つ、臭化物を添加した1%アガロースゲルを調製します。PCR産物4 µLと5X DNAローディングバッファー1 µLを混合します。

96ウェルプレート上のarosゲルの