본 절차의 전반적인 목표는 고효율 PCR을 통해 streptococcus sanguine의 게놈 전반에 걸쳐 단일 유전자 결손을 유도하는 것입니다. 이는 먼저 고효율 PCR 증폭을 통해 항생제 내성 유전자를 포함하여 표적 유전자의 상류 및 하류 DNA 서열까지 총 3개의 앰플리콘(amplicon)을 확보함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 이 3개의 PCR 앰플리콘을 템플릿으로 사용하여 선형 재조합 PCR 앰플리콘을 얻는 것입니다.
다음으로, 수용성 s sanguine 세포를 준비합니다. 마지막 단계는 선형 재조합 PCR 증폭 산물을 수용성 s sanguineous 세포로 형질전환하는 것입니다. 최종적으로 colon A PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱을 통해 정확한 돌연변이체를 검증합니다.
자살 플라스미드(suicide plasmid) 녹아웃과 같이 기존에 사용되던 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 고처리량을 통해 게놈 전반의 결손 돌연변이체를 직접 생성할 수 있다는 점입니다. PCR 프라이머는 streptococcus sanguineous SK 36 게놈 서열을 기반으로 한 내부 스크립트를 사용하여 서면 프로토콜에 기술된 대로 설계 및 합성할 수 있습니다. 타겟 유전자의 상류 1 kb 서열, A PHA 3 유전자 ENC 코딩, 카나마이신 내성 단백질, 그리고 타겟 유전자의 하류 1 kb 서열을 증폭하기 위해 세 세트의 프라이머가 설계되었습니다.
유전자 특이적 프라이머. R1 및 F3는 표적 유전자의 5' 및 3' 서열을 기반으로 설계되어, 표적 S. sanguine genes의 상류 또는 하류 1 kb 영역을 고효율로 증폭합니다. 먼저 15 mL 원추형 튜브에 PCR 칵테일 혼합물을 얼음 위에서 조제합니다.
s sanguineous 게놈 DNA를 포함하는 PCR 혼합물의 성분은 본문을 참조하십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 혼합물 23 µL를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 표적 유전자의 상류 서열을 위해, 멀티채널 피펫을 사용하여 10 µM 농도의 작동 프라이머 플레이트에서 F1 및 R1 프라이머를 각각 1 µL씩 PCR 플레이트로 옮깁니다. 표적 유전자의 하류 서열을 증폭하기 위해 F3 및 R3 프라이머에 대해서도 동일하게 수행합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 94 °C에서 1분 동안 증폭을 수행한 후, 94 °C에서 30초 동안 30회 사이클을 반복합니다.
54 °C에서