O objetivo geral deste procedimento é realizar deleções de genes individuais em todo o genoma em Streptococcus sanguinis por meio de PCR de alto rendimento. Isso é realizado primeiramente obtendo-se três amplicons por amplificação PCR de alto rendimento, incluindo o gene de resistência a antibióticos, bem como as sequências de DNA upstream e downstream do gene alvo. O segundo passo é obter o amplicon recombinante linear por PCR utilizando três amplicons como modelos.
Em seguida, preparam-se as células competentes de s. sanguinis. O passo final consiste em transformar o amplicon recombinante linear obtido por PCR em células competentes de s. sanguinis. Por fim, utiliza-se amplificação por PCR do gene colon A e sequenciamento de DNA para verificar os mutantes corretos.
A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos exaustivos, como o knockout com plasmídeo suicida, é que este método pode criar mutantes com deleção em todo o genoma diretamente, utilizando alto rendimento. Os iniciadores de PCR podem ser projetados e sintetizados conforme descrito no protocolo escrito, utilizando scripts internos baseados na sequência do genoma de Streptococcus sanguineus SK36. Três