本实验的总体目标是利用非洲爪蟾卵提取物作为模型系统，研究DNA损伤检查点。首先，从非洲爪蟾卵中制备低速提取物。然后，采用甲基磺酸甲酯（MMS）和紫外光（UV）等DNA损伤方法处理精子染色质，以制备受损的精子染色质。
同时制备模拟DNA损伤的结构。使用T70或受损的精子染色质处理LSE，以激活DNA损伤检查点。最终，印迹实验结果可揭示非洲爪蟾卵提取物中由ATR介导的DNA损伤检查点的激活情况。
大家好。我是来自北卡罗来纳大学夏洛特分校生物系的CH Y。今天我们将向您展示如何利用脓液提取物作为模型系统来研究损伤触发的信号通路。
该方法有助于解答动态不稳定性研究领域中的关键问题，例如D损伤检查点是如何被激活的。本方案适用于制备卵母细胞提取物和DNA损伤检查点诱导试剂，并用于分析DNA损伤检查点和xap。这些技术可适用于多种DNA损伤方法，包括四氮醌（NQO）和依托泊苷。
为了研究DNA损伤检查点，让我们开始实验。通过向非洲爪蟾雌蛙的背侧淋巴囊皮下注射100单位的PMSG，对其进行促排卵预处理。在预处理至少两天后，通过向每只已预处理的青蛙背侧淋巴囊皮下注射500单位的人绒毛膜促性腺激素（hCG）以诱导产卵。将注射后的青蛙分别置于装有两升Marx改良林格溶液的桶中，于14至20小时内孵育。
将青蛙从桶中取出，倒掉MMR溶液，直至剩余约100毫升。然后将卵从桶中转移至250毫升烧杯中，通过每隔约30秒加入100毫升pH 7.8的2%半胱氨酸溶液进行去胶处理。使用直径为0.7厘米的倒置玻璃巴氏吸管轻轻搅动卵，倾去并更换新鲜的半胱氨酸溶液两次。
脱膜过程大约需要5到15分钟。当卵子在烧杯底部形成更为致密的一层后，弃去半胱氨酸溶液，用0.25 XMMR溶液将卵子洗涤三次。用玻璃移液管轻轻搅动卵子，并检查位于烧杯中央的膨胀发白的坏卵。
用移液管去除坏卵。接着，用卵裂解缓冲液洗涤卵三次。去除任何额外的坏卵，然后将卵倒入一个14毫升的离心管中。
将卵通过离心在188 × g下压缩55秒。使用带有摆动桶转子的临床台式离心机，除去卵层上方多余的缓冲液。现在，每1毫升压缩后的卵中加入0.5 µL浓度为10 mg/mL的抑肽酶、瘦素或AL，以及0.5 µL浓度为5 mg/mL的细胞因子B或cyto B，在4°C下以16,500 × g离心15分钟。使用Sarva RC 6 Plus超速离心机配备HB 6摆动桶转子，离心后卵在离心管中分为三层，从上至下分别为脂质提取物和卵黄色素。用21号针头在Falcon管中层提取物下部侧面穿刺。
小心移除针头，因为穿刺针可能会被塑料堵塞。将连接在一毫升注射器上的新21号针头插入穿刺部位，以收集提取物。
缓慢吸取提取物，避免产生气泡，并防止与脂质层和卵黄色素层发生污染。将提取物转移至预冷的1.5毫升微量离心管中。每1毫升卵黄提取物中加入10微升10毫克/毫升的试剂。
环己酰亚胺：