この手順の全体的な目的は、xip卵抽出液をモデルシステムとして用いて、DNA損傷チェックポイントを調査することです。まず、xip卵から低速抽出液を調製します。次に、MMSやUV照射などのDNA損傷手法を用いて、損傷した精子クロマチンを調製します。

また、DNA損傷模倣構造を準備します。損傷した精子クロマチンまたはa T 70を用いて、LSEにおけるDNA損傷チェックポイントを誘発させるためにa T 70を添加します。最終的に、ブロットの結果から、ゼノプスの卵抽出液におけるa TR check one介在性のDNA損傷チェックポイントに関する知見を得ることができます。

こんにちは。UNCシャーロット大学生物学科のCH Yです。本日は、ダメージテックポイントシグナリングを調査するためのモデルシステムとして、膿抽出液をどのように使用するかについて説明します。

この手法は、DNA損傷チェックポイントがどのように活性化されるかなど、ダイナミック不安定性分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルでは、opus卵抽出液およびDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製と、DNA損傷チェックポイントおよびxapの解析について説明します。これらの手法は、4NQOやエトポシドを含むさまざまなDNA損傷アプローチに適応可能です。

DNA損傷チェックポイントの研究を開始しましょう。メスのアフリカツメガエルを皮下プライミングするために、背側リンパ嚢にPMSG 100 unitsを注射します。プライミングから最低2日間待機した後、プライミング済みの各カエルにヒト絨毛性ゴナドトロピン500 unitsを背側リンパ嚢に皮下注射して産卵を誘導します。注射後のカエルは、2リットルのMarx modified ringer solutionを入れた個別のバケツの中で14～20時間インキュベートしてください。

バケツからカエルを取り出し、MMR溶液を約100 milliliters残して捨てます。次に、卵をバケツから250 milliliterビーカーに移し、2%cysteine (pH 7.8) を約30秒ごとに100 millilitersずつ加えて、卵のゼリー層を除去します。直径0.7 centimetersの逆さまにしたガラスパステールピペットで卵を静かに撹拌し、システイン液をデカンテーションで取り除いて新しいシステイン液と交換する操作を2回繰り返します。

脱包膜（de-detailing）プロセスは約5分から15分で完了します。卵がビーカーの底に凝縮した層を形成したら、システイン溶液を捨て、0.25 XMMR溶液で卵を3回洗浄してください。ガラスピペットで卵をかき混ぜ、ビーカーの中央に集まりやすい、白く膨らんだ不良卵がないか確認します。

パスチャーピペットを使用して、不良卵を除去します。