본 절차의 전반적인 목표는 xip 난자 추출물을 모델 시스템으로 사용하여 DNA 손상 체크포인트를 조사하는 것입니다. 먼저, xip 난자에서 저속 추출물을 준비하십시오. 그다음, MMS 및 UV 광선과 같은 DNA 손상 유도 방법을 통해 손상된 정자 염색질을 준비하십시오.
또한 DNA 손상을 모방한 구조를 준비하십시오. 손상된 정자 염색질 또는 aT70을 사용하여 LSE에서 DNA 손상 체크포인트를 유발하도록 aT70을 진행합니다. 최종적으로, 블롯 결과는 제노푸스(xenopus) 난자 추출물 내의 aTR check one 매개 DNA 손상 체크포인트에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.
안녕하세요. UNC 샬럿 생물학과(department biology)의 CH Y입니다. 오늘은 pus 추출물이 DNA 손상 체크포인트 신호 전달(damage tech point signaling)을 조사하기 위한 모델 시스템으로 어떻게 사용되는지 보여드리겠습니다.
이 방법은 DNA 손상 체크포인트가 어떻게 활성화되는지와 같이 동적 불안정성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜은 Xenopus 난자 추출물과 DNA 손상 체크포인트 유도 시약의 준비, 그리고 DNA 손상 체크포인트 및 Xap의 분석을 위한 것입니다. 이러한 기술은 4-NQO 및 etoposide를 포함한 다양한 DNA 손상 유발 방식에 적용 가능합니다.
DNA 손상 체크포인트를 연구하기 위해 실험을 시작하겠습니다. 암컷 Xenopus laevis 개구리를 피하 프라이밍하기 위해, 등쪽 림프낭에 PMSG 100 units를 주입하십시오. 프라이밍 후 최소 이틀을 기다린 다음, 프라이밍된 각 개구리의 등쪽 림프낭에 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) 500 units를 피하 주입하여 산란을 유도하십시오. 주입 후 개구리들을 2L의 Marx modified ringer solution이 담긴 개별 버킷에서 14~20시간 동안 배양하십시오.
버킷에서 개구리를 꺼내고 MMR 용액을 약 100 milliliters가 남을 때까지 따라냅니다. 그런 다음 버킷의 알을 250 milliliter 비커로 옮기고, 약 30초마다 2% cysteine pH 7.8 용액 100 milliliters를 첨가하여 알의 젤리층을 제거합니다. 직경 0.7 centimeters의 역방향 유리 파스퇴르 피펫으로 알을 부드럽게 저어