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Un'introduzione alla centrifuga

Overview

La centrifuga è uno strumento utilizzato in quasi tutti i laboratori di ricerca in tutto il mondo. La centrifugazione è il processo mediante il quale una centrifuga viene utilizzata per separare i componenti di una miscela complessa. Facendo ruotare campioni di laboratorio a velocità molto elevate, i componenti di una data miscela sono sottoposti a forza centrifuga, che fa sì che le particelle più dense migrino lontano dall'asse di rotazione e quelle più leggere si muovano verso di esso. Queste particelle possono sedimentare sul fondo del tubo in quello che è noto come un pellet, e questo campione isolato, o la soluzione rimanente, il surnatante, può essere ulteriormente elaborato o analizzato. Questo video ha lo scopo di introdurre uno studente ad alcuni dei principi di base della centrifugazione, nonché al funzionamento di base dello strumento. Ad esempio, la velocità di centrifugazione in rotazioni al minuto, o RPM, è contrastata con la forza centrifuga relativa, o RCF, come misura della grandezza della centrifugazione, che è indipendente dalla dimensione del rotore. Oltre ai concetti e all'uso di base, vengono discusse le precauzioni di sicurezza relative alla centrifugazione, nonché i tipi di centrifughe e rotori di centrifughe esistenti.

Procedure

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La centrifuga è uno strumento utilizzato in quasi tutti i laboratori di ricerca biomedica in tutto il mondo.

La centrifugazione è un processo mediante il quale una centrifuga viene utilizzata per separare i componenti di una miscela complessa.

Facendo ruotare campioni di laboratorio a velocità molto elevate, i componenti di una data miscela sono sottoposti a forza centrifuga, che fa sì che le particelle più dense migrino lontano dall'asse di rotazione e quelle più leggere si muovano verso di esso. Queste particelle possono sedimentare sul fondo del tubo in quello che è noto come un pellet, e questo campione isolato, o la soluzione rimanente, il surnatante, può essere ulteriormente elaborato o analizzato.

Il componente principale di una centrifuga è il rotore, che è la parte mobile che gira ad alta velocità.

I rotori possono essere fissati in posizione, oppure una centrifuga può utilizzare più rotori fissati in cima alla parte chiamata mandrino.

Di solito, il rotore della centrifuga avrà un coperchio avvitato saldamente per evitare che i campioni volino fuori.

Molte centrifughe avranno un'unità di refrigerazione che consente di controllare la temperatura interna durante la centrifuga.

Hanno anche manopole o pulsanti per l'inserimento dei parametri per ogni corsa, che possono includere la durata dello spin, la temperatura e l'entità dello spin in termini di velocità o forza relativa.

La velocità di rotazione viene misurata come RPM o giri al minuto. RPM è un valore difficile, perché non è la velocità della centrifuga che fa sì che le particelle si separino da una miscela, ma la forza che agisce su queste particelle.

La forza che agisce su una particella è correlata al raggio del rotore della centrifuga e, poiché diverse centrifughe hanno dimensioni del rotore diverse, è possibile applicare forze diverse alla stessa velocità o RPM.

La forza di centrifugazione può anche essere quantificata come forza centrifuga relativa o RCF. RCF è generalmente presentato come un multiplo dell'accelerazione gravitazionale terrestre.

RCF è espresso come il prodotto del raggio del rotore e il quadrato della velocità angolare diviso per l'accelerazione gravitazionale terrestre.

RCF può essere correlato a RPM dalla seguente equazione, dove sono sta per il raggio della centrifuga misurato in centimetri.

L'uso di questa equazione può significare la differenza tra un esperimento fallito o riuscito, ma non è necessario applicare questo calcolo per ogni nuova procedura. Le centrifughe sono spesso dotate di nomogrammi che possono aiutare a convertire RCF in RPM abbastanza facilmente. Utilizzare un righello per collegare il raggio della centrifuga e un dato valore RPM, al fine di ottenere RCF.

Per iniziare a girare i campioni considera la temperatura. Se si utilizza una centrifuga refrigerata, si desidera che la temperatura interna delle macchine raggiunga il valore desiderato prima di iniziare la centrifuga, oppure è possibile trovare altri modi per raffreddare il rotore.

Immediatamente prima di una rotazione, assicurarsi che tutti i tappi dei tubi siano serrati e sicuri.

Quando si caricano le provette, assicurarsi che ogni campione sia controbilanciato con un altro campione direttamente di fronte ad esso.

Se hai solo un tubo, crea un altro tubo che possa fungere da contrappeso.

Se hai tre tubi, puoi disporli in un triangolo in modo che siano equidistanti l'uno dall'altro.

Bilanciare i pesi in una centrifuga è fondamentale. I rotori delle centrifughe raggiungono velocità elevate e hanno molta energia cinetica. Se bilanciata in modo improprio, l'intera unità di centrifuga può essere spinta dal suo luogo di riposo e fare gravi danni.

Una volta confermato che il rotore e il coperchio sono sicuri, avviare la centrifuga e rimanere in giro fino a quando non ha raggiunto la velocità desiderata. Se noti un problema chiama e un membro esperto del laboratorio per venire ad aiutarti.

Quando la centrifugazione è completa, dovresti essere in grado di vedere il tuo campione biologico sul fondo del tubo in un pellet, che si è separato dal resto della soluzione, o surnatante.

Il surnatante può essere rimosso decantandolo - un nome di fantasia per versarlo, oppure può essere aspirato - un termine di fantasia per l'uso dell'aspirazione per rimuoverlo.

Il campione purificato può quindi essere restituito a una soluzione tramite un processo chiamato, risosocienze. Le ripetizioni di centrifugazione, o cellule rotanti, seguite da cellule aspiranti e riconsocienze in buffer, sono spesso indicate come cellule di lavaggio.

Ora che hai visto alcune basi della centrifugazione, è il momento di dare un'occhiata ad alcuni dei tipi di centrifughe là fuori e alle procedure che puoi eseguire con loro.

Le centrifughe a rotore ad angolo fisso sono probabilmente il tipo più comune di questo strumento che incontrerai in laboratorio. Molte centrifughe da tavolo rientrano in questa categoria.

Queste centrifughe, in cui i tubi si trovano in posizione fissa e angolata, sono utilizzate nei protocolli di centrifugazione differenziale. In questi protocolli, una serie di centrifugazioni a diverse velocità possono essere utilizzate per purificare campioni biologici come le cellule animali. In genere, questi protocolli comportano diverse fasi di lavaggio delle cellule.

A differenza dei rotori ad angolo fisso, i rotori oscillanti hanno supporti per tubi flessibili che consentono ai campioni di ruotare verso l'esterno. Questi rotori sono utili in applicazioni come la centrifugazione a gradiente di densità, in cui i campioni biologici migrano verso strati distinti di mezzi gradienti. Questo tipo di centrifugazione è utile per isolare rapidamente un tipo di cellula da un altro o per isolare singoli organelli.

Infine, l'ultracentrifuga è il fratello maggiore di tutte le centrifughe che troverai in laboratorio. Può ruotare oltre i 70.000 giri / min, il che lo rende adatto per l'isolamento di piccole particelle, come DNA o virus.

A causa delle elevate velocità di questa centrifuga, è necessario prestare particolare attenzione per garantire che i carichi siano adeguatamente bilanciati e che sia il rotore che il coperchio siano sicuri.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla centrifugazione. In questo video abbiamo recensito: cos'è una centrifuga e come funziona, come far funzionare e far funzionare una centrifuga, alcune precauzioni di sicurezza e diverse applicazioni della tua centrifugazione. Grazie per aver guardato e ricordati di bilanciare i tuoi tubi.

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