Overview
Il lettore di micropiasse è uno strumento multimodale che consente di eseguire e misurare contemporaneamente una varietà di esperimenti. I lettori di micropiasche possono effettuare misurazioni di assorbanza, fluorescenza e luminescenza. Le piastre multiwell sono parte integrante del lettore di micropiasche e consentono di eseguire molti esperimenti contemporaneamente. Indipendentemente dal tipo di saggio, gli esperimenti sul lettore di piastre utilizzano una curva standard per determinare i valori sperimentali. Questa curva utilizza campioni di concentrazione nota per generare una linea di migliore adattamento o curva standard. I valori sperimentali vengono quindi estrapolati alla curva o calcolati utilizzando l'equazione della regressione lineare. Oltre agli standard e ai campioni eseguiti sulla piastra multiparete, il bianco insieme ai controlli positivi e negativi vengono utilizzati anche nel test per garantire che funzioni correttamente. I lettori multiplati vengono utilizzati per quantificare le proteine, l'espressione genica e vari processi metabolici come le specie reattive dell'ossigeno e il flusso di calcio.
Procedure
Il lettore di micropiasche è uno strumento ampiamente utilizzato che consente di misurare contemporaneamente molti campioni, come se venissero eseguiti contemporaneamente molti minuscoli esperimenti.
Questo apparecchio viene utilizzato in combinazione con piastre multiwell, come la piastra a 96 pozzi.
Indipendentemente dal tipo di esperimento eseguito con il lettore di micropiassure, le curve standard vengono spesso utilizzate per determinare il valore dei campioni sperimentali, nonché i controlli positivi e negativi.
I lettori di micropiasche sono disponibili in diverse forme, dimensioni e configurazioni. Molti lettori di micropiasse hanno capacità multimodali che consentono di eseguire molti test diversi. Queste modalità includono la capacità di eseguire diversi tipi di misurazioni, come misure di assorbimento, fluorescenti e luminescenti.
Le piastre multiplo sono componenti integranti del lettore di micropiasche e vengono utilizzate per contenere i campioni misurati dalla macchina. Queste piastre possono essere di diverse dimensioni, hanno diversi tipi di fondi di pozzi e diversi numeri di pozzi. Il tipo di piastra utilizzata dipende dal test.
Il vassoio di carico viene utilizzato per portare la piastra a 96 pozzi nella macchina.
Un'interfaccia computer viene in genere utilizzata per azionare il lettore di piastre e controllarne le impostazioni e i parametri, come la lunghezza d'onda e la modalità. Il software di lettura delle lastre ha un'interfaccia utente grafica della piastra che consente di selezionare quali pozzetti sono caricati con campioni.
Le pipette multicanale sono spesso utilizzate per caricare piastre multi-pozzo. I serbatoi contengono le soluzioni per la pipetta multicanale.
I pozzette a volte possono essere caricati utilizzando una pipetta standard a canale singolo.
I campioni e gli standard vengono caricati in duplice copia o triplice per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio. Qui vedete una piastra caricata in triplice copia.
La curva standard utilizza campioni con concentrazioni note, che producono diversi valori di assorbanza. Questi dati vengono quindi utilizzati per creare un grafico in cui viene generata una linea di adattamento migliore.
Lo spazio vuoto viene utilizzato per determinare l'estensione della misurazione che non è rilevante dal punto di vista sperimentale ed è dovuta ai tamponi in cui il campione è diluito o ai reagenti a cui il campione è esposto. I valori ottenuti da queste misurazioni sono chiamati "sfondo". Lo spazio vuoto non contiene alcun campione.
Il controllo positivo indica se il test ha funzionato correttamente o meno. Dà un buon risultato. Il controllo negativo è una variabile di controllo in cui non si prevede di osservare alcuna misurazione/effetto. Non dovrebbe produrre alcun risultato..
Una volta impostata la piastra, è il momento di caricare i campioni. Per evitare di misurare i campioni sbagliati o di caricare la piastra nel modo sbagliato, è fondamentale orientare correttamente la piastra nel vassoio di carico. Ricordarsi di prestare attenzione quando si caricano i campioni nel vassoio, in modo da non forzare il vassoio nello strumento o catturare le estremità all'interno dello strumento.
Una volta caricato il vassoio, parametri come la modalità, la lunghezza d'onda e l'ordine di caricamento del pozzo vengono impostati nel software prima che la piastra venga letta.
Dopo aver impostato i parametri, la piastra viene letta e il lettore genera una lettura dei valori all'interno del software.
Una volta letta la piastra, utilizzare il valore medio dei campioni vuoti per sottrarre lo sfondo da tutti i campioni, inclusa la curva standard.
Dopo la lettura, i valori di concentrazione noti per gli standard vengono tracciati rispetto ai rispettivi valori misurati, in questo caso l'assorbanza.
Quando i valori sono stati tracciati, la linea di adattamento migliore può essere calcolata utilizzando una regressione lineare. Questo può essere fatto facilmente utilizzando un programma di fogli di calcolo.
Il coefficiente di determinazione, una misura statistica di quanto bene la linea prevede i punti dati effettivi, dovrebbe essere compreso tra 0,90-0,99, con 0,99 considerato il valore migliore e significa che la linea si adatta perfettamente ai dati.
Usando la linea di migliore adattamento, possiamo calcolare i valori di concentrazione di campioni sperimentali o controlli in ciascun pozzo collegando il valore di assorbanza per Y e quindi risolvendo l'equazione per X. I valori di concentrazione possono anche essere stimati disegnando una linea dal valore di assorbanza sull'asse Y alla linea di adattamento migliore e quindi fino all'asse X.
Molti tipi di lettori di micropiasche misurano l'assorbanza, che è definita come il rapporto logaritmico della luce che cade su un oggetto rispetto alla luce trasmessa attraverso un oggetto.
Il saggio di Bradford è un esempio di un test del lettore di micropiassure basato sull'assorbanza, in cui i campioni proteici vengono aggiunti alla piastra con il reagente "Bradford". Questo composto si lega alle proteine nel campione e causa uno spostamento nella sua assorbanza.
Nei saggi a base fluorescente, un fluorocromo viene attivato da una certa lunghezza d'onda della luce e a sua volta provoca l'eccitazione del fluorocromo, che emette luce a una lunghezza d'onda diversa.
Quando si lavora con reagenti sensibili alla luce, assicurarsi di tenerli coperti per evitare il fotosciviazione e rovinare l'esperimento.
I saggi luminescenti emettono luce attraverso una reazione chimica e spesso usano la luciferasi. Luciferasi proviene da una serie di fonti come le lucciole. In una reazione di luciferasi, la luce viene emessa quando la luciferasi incontra ossigeno, ATP e magnesio in una serie di reazioni.
I saggi luminescenti hanno molte applicazioni diverse. Un esempio di questa applicazione è la misurazione della produzione e del rilevamento di specie reattive dell'ossigeno nei tumori.
Altre applicazioni, che utilizzano lettori di micropiasche, includono saggi ad alto rendimento che utilizzano pozzi da 384 e 1536. In questi test, le piastre vengono caricate da un robot. No, non quel tipo di robot. Un robot programmabile che automatizza la gestione estremamente precisa dei campioni.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al lettore di micropiasse. In questo video, abbiamo mostrato cos'è un lettore di microlati (A), come viene utilizzato (B), come utilizzare questo strumento (C), come interpretare i dati del lettore di micropiasse e alcune applicazioni utilizzando un lettore di micropiasse (D). Grazie per aver guardato.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
