Summary
Overview
Das Mikroplatten-Photometer ist ein multimodales Instrument, das einem erlaubt verschiedene Experimente zur gleichen Zeit auszuführen und zu messen. Multiplatten-Photometer können Absorption, Fluoreszenz oder Lumineszenz Messungen durchführen. Multiwell-Platten sind ein fester Bestandteil des Multiplatten-Photometers und erlauben das verschiedene Experimente auf einmal durchgeführt werden können. Unabhängig von der Art des Expertiments werden Standardkurven benutzt, um Messwerte experimentell zu bestimmen. Die Standardkurve wird mit bekannten Konzentrationswerten und den daraus resultierenden Messwerten erstellt. Experimentelle Werte werden dann unter Benutzung der Standardkurve extrapoliert, oder durch lineare Regression berechnet. Neben der Standardkurve und den Proben sollte auch immer ein Blindwert und Positiv- und Negativkontrollen gemessen werden, um sicherzustellen dass das Experiment richtig funktioniert. Multiplatten-Photometer werden benutzt, um Proteinkonzentrationen, Genexpressionsraten oder metabolische Prozesse, wie freie Radikale oder Kalziumfluxraten, zu bestimmen.
Procedure
Ein Mikroplatten-Photometer ist ein häufig genutztes Laborinstrument, mit dem viele Proben gleichzeitig gemessen werden können, so als würden viele Experimente zur gleichen Zeit parallel ausgeführt werden.
Dieses Gerät wird häufig zusammen mit Multiwell Platten (zum Beispiel 96-Well Platten) genutzt.
Unabhängig von der Art des Experimentes werden Standardkurven, Positiv- und Negativkontrollen genutzt, um den Messwert der Proben zu ermitteln.
Mikroplatten-Photometer existieren in vielen verschiedenen Formen, Größen und Ausführungen. Viele Mikroplatten-Photometer haben multimodale Ausführungen, damit verschiedene Arten von Versuchen und Messungen durchgeführt werden können. Diese Modalitäten beinhalten zum Beispiel die Messungen von Absorption, Fluoreszenz und Lumineszenz.
Multiwellplatten sind wichtige Bestandteile des Mikroplatten-Photometers. Sie dienen als Reservoirs, die Proben für Messungen fassen. Multiwellplatten können verschiedene Gößen, aber auch verschiedene Welltypen und Wellanzahlen haben. Welche Platte benutzt wird, hängt häufig vom Experiment ab.
Das Ladetablett ist dazu da, um die 96-Well Platte in die Maschine einzuführen.
Eine Computerschnittstelle wird typischerweise verwendet, um das Mikroplatten-Photometer zu programmieren und verschiedene Parameter, wie zum Beispiel die Wellenlänge oder den Modus, auszusuchen. Die Software hat eine Benutzeroberfläche, auf der die jeweilige Platte repräsentiert ist und mit der man aussuchen kann welche Wells zu messen sind.
Mehrkanalpipetten werden oft verwendet um Multiwellplatten zu füllen. Die Reservoirs fassen die Lösungen der Mehrkanalpipette. Einzelne Wells können manchmal jedoch auch mit einer einfachen Pipette gefüllt werden.
Proben und Standards können als Duplikat oder Triplikat gefüllt werden, um eventuellen Pipettierfehlern vorzubeugen. Hier zeigen wir eine Multiwellplatte, die in Triplikaten gefüllt wird.
Die Standardkurve wird mit bekannten Stoffkonzentrationen, die zu verschiedenen Absorptionswerten führen, ermittelt. Diese Daten werden dann genutzt, um eine Kurve zu bestimmen.
Der Blindwert wir verwendet, um zu messen welche probenunabhängigen Absorptionen, zum Beispiel durch Puffer oder Reagenzien, auftreten. Die Werte von diesen Messungen werden als Hintergrundwerte bezeichnet. Die Blindwertmessung wird dementsprechend ohne Probe durchgeführt.
Die Positivkontrolle gibt Aufschluss darüber, ob die Messung funktioniert hat, indem sie ein zu erwartendes Resultat anzeigt. Die Negativkontrolle ist eine Messung in der kein experimenteller Effekt zu erwarten oder zu beobachten ist und sollte deshalb zu keinem Ergebnis führen.
Wenn die Platte fertig vorbereitet ist, wird es Zeit die Proben anzusetzen. Um zu verhindern das die falschen Proben oder Proben in falscher Reihenfolge angesetzt werden, ist es wichtig die Platte in korrekter Position auf der Ladefläche zu positionieren. Man sollte vorsichtig beim Einführen der Platte sein, und die Platte auf keinen Fall in das Instrument zwingen oder sich die Finger einklemmen.
Nach dem Einführen der Platte können verschiedene Parameter, wie zum Beispiel der Modus, die Wellenlänge oder die Reihenfolge der Wells, mit Hilfe der Software bestimmt werden.
Nachdem die Parameter eingegeben sind, wird die Platte gelesen und das Photometer generiert Werte und gibt diese an die Software weiter.
Nach dem Lesen der Platte, wird der Durchschnitt der Blindwertmessungen berechnet und von den Probenwerten, einschliesslich denen der Standardkurve, abgezogen.
Nach der Messwertbestimmung werden die bekannten Konzentrationen des Standards gegen die jeweiligen Messwerte, in unserem Fall Absorpitionen, graphisch dargestellt. Danach kann die Kurve durch lineare Regression berechnet werden. Diese Berechnung kann auch einfach in einem Excel spreadsheet ausgeführt werden.
Der Determinationskoeffizient ist ein statistisches Maß für wie gut die Kurve einen Datenpunkt vorhersagt. Er sollte zwischen 0,9-0,99 liegen. 0,99 ist der bestmöglichste Wert, was bedeutet das die Kurve perfekt mit den Daten übereinstimmt.
Die Kurve mit dem besten Determinationskoeffizienten wird dann genutzt, um die Konzentrationen der gemessen Werte zu bestimmen, indem man deren Absorptionswerte für Y einsetzt und die Gleichung nach X löst. Die Konzentrationswerte können auch einfach geschätzt werden, indem man eine Linie von den Absorptionswerten auf der Y-Achse zu der Kurve zieht, und dann den entsprechenden Wert auf der X-Achse abliest.
Die meisten Mikroplatten-Photometer messen Absorptionswerte. Diese sind definiert als das logrithmische Verhältnis des einfallenden zu austretenden Lichts.
Der Bradford Assay ist eine Mikroplatten-Photometermethode, die auf dem Messen von Absorptionswerten basiert. Die Proteinproben werden zu der Bradfordlösung hinzugefügt. Die Bradfordsubstanz bindet sich dann an das Protein, was zu einer Veränderung des Absorpotionsspektrums führt.
In Experimenten die auf Fluoreszenzmessungen basieren, wird ein Fluorochrom durch eine bestimmte Wellenlänge von Licht aktiviert, welches daraufhin Licht einer anderen Wellenlänge emittiert.
Lichtempfindliche Reagenzien sollte man möglichst dunkel lagern, um ein Ausbleichen zu verhindern, was zum Misslingen des Experimentes führen kann.
Exerpimente die auf Lumineszenz basieren, emittieren Licht durch eine chemische Reaktion, die oft auf Luziferase basiert. Luziferase kann durch verschiedene Quellen gewonnen werden, zum Beispiel aus Glühwürmern. In der Luziferasereaktion wird Licht emittiert wenn Sauerstoff, ATP und Magnesium in verschiedenen Schritten auf die Luziferase treffen.
Experimente mit Lumineszenz haben viele verschiedene Anwendungen. Ein Beispiel ist die Messung der Produktion von freien Sauerstoffradikalen in Krebszellen.
Andere Anwendungen des Mikroplatten-Photometers sind Hochdurchsatzmessungen mit 384 oder 1536-Well Platten. Hier werden Platten durch Roboterarme gefüllt. Ein programmierbarer Roboter kann die Probenfüllung mit hoher Präzesion automatisieren.
Das war die Einführung in die Benutzung von Mikroplatten-Photometern von JoVE. In diesem Video haben wir gelernt was ein Mikroplatten-Photometer ist, wie das Instrument genutzt und programmiert wird, wie man Mikoplatten-Photometerdaten analysiert und welche Anwendungen es gibt. Danke für eure Aufmerksamkeit!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
