Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
General Laboratory Techniques

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

מבוא למיקרוסקופיה פלואורסצנטית
 
Click here for the English version

מבוא למיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Overview

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות היא כלי אנליטי רב עוצמה המשלב את המאפיינים המגדלים של מיקרוסקופיה קלה עם הדמיה של פלואורסצנטיות. פלואורסצנטיות היא תופעה הכרוכה בספיגה ופליטה של מגוון קטן של אורכי גל אור על ידי מולקולה פלואורסצנטית המכונה פלואורופור. מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מושגת בשילוב עם מיקרוסקופ האור הבסיסי על ידי הוספת מקור אור רב עוצמה, מסננים מיוחדים ואמצעי לתיוג פלואורסצנטי של מדגם. סרטון זה מתאר את העקרונות הבסיסיים העומדים מאחורי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות, כולל מנגנון הפלואורסצנטיות, השינוי של הסטוק והלבנת תמונות. זה גם נותן דוגמאות של דרכים רבות לתייג פלואורסצנטי מדגם כולל שימוש בנוגדנים וחלבונים מתויגים פלואורסצנטית, צבעי פלואורסצנטי חומצת גרעין עם, ותוספת של חלבונים פלואורסצנטיים טבעיים לדגימה. המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות כולל מקור אור קסנון או כספית, מסנני אור, המראה הדיכרואית והשימוש בתריס כדי להאיר את המדגם מתוארים כולם. לבסוף, דוגמאות של כמה יישומים רבים עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצגים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פלואורסצנטיות היא תופעה המתרחשת כאשר חומר סופג אור אורך גל נתון ולפוט אור אורך גל אחר. פלואורסצנטיות מתרחשת כאלקטרון, שהתרגש ממצב אנרגיה גבוה ולא יציב יותר, נרגע למצב הקרקע שלו ומפרוט פוטון של אור. האור האחראי על עירור, או הזזת האלקטרון למצב אנרגיה גבוה יותר, הוא בעל אורך גל קצר יותר ואנרגיה גבוהה יותר מפליטת הפלואורסצנטיות, שיש לה אורך גל ארוך יותר, אנרגיה נמוכה יותר וצבע שונה.

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות משלבת את התכונות המגדלות של מיקרוסקופ האור עם טכנולוגיית פלואורסצנטיות המאפשרת עירור וזיהוי פליטות מ- פלואורופורים - תרכובות כימיות פלואורסצנטיות. עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מדענים יכולים לבחון את המיקום של סוגי תאים ספציפיים בתוך רקמות או מולקולות בתוך תאים.

המרכיבים העיקריים של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי חופפים מאוד למיקרוסקופ האור המסורתי. עם זאת 2 ההבדלים העיקריים הם סוג של מקור אור ואת השימוש של רכיבי מסנן מיוחדים.

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות דורשת מקור אור חזק מאוד כגון קסנון או מנורת קשת כספית כמו זו המוצגת כאן. האור הנפלט מנורת קשת הכספית בהיר פי 10-100 מרוב מנורות ליבון ומספק אור במגוון רחב של אורכי גל, מאולטרה סגול ועד אינפרא אדום. מקור אור רב עוצמה זה הוא החלק המסוכן ביותר של הגדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות כמו להסתכל ישירות לתוך אור לא מסונן יכול לפגוע קשות ברשתית שלך טיפול לקוי הנורות יכול לגרום להם להתפוצץ.

העיקרון מאחורי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות הוא פשוט. כאשר האור עוזב את מנורת הקשת הוא מכוון דרך מסנן מרגש, אשר בוחר את אורך הגל העירור.

אור זה משתקף כלפי המדגם על ידי מראה מיוחדת הנקראת מראה דיכרואית, אשר נועדה לשקף אור רק באורך גל העירור. האור המוחזרים עובר דרך המטרה שבה הוא מתמקד בדגימה הפלואורסצנטית. הפליטות מהדגימה הן בתורן, מועברות בחזרה דרך המטרה – שם מתרחשת הגדלה של התמונה – ועכשיו דרך המראה הדיכרואית.

אור זה מסונן על ידי מסנן המחסום, שבוחר עבור אורך הגל של הפליטה ומסנן אור מזהם מנורת הקשת או ממקורות אחרים המוחזרים מרכיבי המיקרוסקופ. לבסוף, פליטת הפלואורסצנט המסוננת נשלחת לגלאי שבו ניתן הפוך את התמונה לדיגיטלית, או שהיא מועברת לעין לצפייה אופטית.

ניתן להרכיב יחד את מסנן ה- exciter, השיקוף הדיכרוכי ומסנן המחסום לרכיב המכונה קוביית המסנן. ניתן לשנות קוביות סינון שונות במהלך צפייה בדגימה כדי לשנות את אורך הגל של העירור, וניתן להשתמש בסדרה של דיאפרמה כדי לשנות את עוצמת העירור.

כשמדובר בביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הפלואורופור יכול להיות חשוב בדיוק כמו המיקרוסקופ עצמו, וסוג הפלורופור שמצטולם מכתיב את אורך הגל העירור המשמש ואת אורך גל הפליטה שזוהה. אורכי הגל של העירור מכילים מגוון קטן של אנרגיות שיכולות להיספג על ידי הפלורופור ולגרום לו לעבור למצב נרגש. לאחר נרגש, מגוון רחב של פליטות, או מעברים בחזרה למצב האנרגיה התחתון, אפשריים וכתוצאה מכך ספקטרום פליטה.

ההבדל בין שיא הספיגה, או עקומת העירור לבין שיא עקומת הפליטה ידוע בשם Shift של סטוק. המרחק בשינוי הזה גדול יותר, כך קל יותר להפריד בין שני אורכי הגל השונים. בנוסף, כל ספקטרום חופף צריך להיות מוסר על ידי הרכיבים של קוביית המסנן עבור רקע מופחת ואיכות תמונה משופרת.

חשיפה של פלואורופור להתרגשות ממושכת תגרום לו להלבין, שהוא היחלשות או אובדן פלואורסצנטיות. כדי להפחית את ההלבנה, ניתן להוסיף מדיום להרכבה נגד עמעום לשקופית ולאטום את הקצוות עם לק. יש לשמור את השקופית גם בחושך כאשר היא אינה מוצגת.

כדי להתחיל הדמיית פלואורסצנטיות, הפעל את מקור האור של הקסנון או הכספית ואפשר לו להתחמם במשך 15 דקות על מנת שהוא יגיע לתאורה מתמדת.

לאחר מכן, הניחו את הדגימה שלכם על הבמה והאבטחו אותה במקום. לאחר מכן, הפעל את מקור האור הלבן של המיקרוסקופ שלך. התמקד במדגם שלך באמצעות המטרה המופעלת הנמוכה ביותר על-ידי התאמת ידיות המיקוד ה גסות והטובות. לאחר מכן, השתמש במידיות התאמת הבמה כדי למצוא את תחום העניין שלך.

לאחר מכן, כבה את מקור האור הלבן, כמו גם את כל אורות החדר המיותרים כדי להפחית את הרקע.

בחר את קוביית הסינון הנכונה עבור הצבע שאתה מדמה ופתח את התריס כדי להאיר את הדגימה.

לבסוף, לבצע התאמות מיקוד עדינות ולכוון את נורית היציאה למצלמת ההדמיה. סביר להניח שיהיה עליך לבצע התאמות לזמן החשיפה עבור כל פלואורופור שונה או צבע פלואורסצנטי בשימוש. עם זאת, חשוב לשמור על זמן החשיפה קבוע בעת השוואת תכונות עם אותו צבע על דגימות שונות.

כדי לדמות צבעים מרובים באותה דגימה, שנה את קוביית המסנן כך שתתאים לכל פלואורופור והקלט את התמונה החדשה.

לאחר שכל צבע במדגם התמונה התמונה, ניתן להסתים ולמזג תמונות בודדות.

סוגים רבים ושונים של ניסויים יכולים לעשות שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולכלול סוגים שונים של פלואורופורים אחד היישומים הנפוצים ביותר של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא הדמיה של חלבונים שסומנו בנוגדנים המחוברים, או "מצומדים" לתרכובות פלואורסצנטיות.. כאן, נוגדן לחלבוני פני השטח לפטוספירליים זוהה באמצעות נוגדן משני מצומד לאלכספלואור-488, אשר פלואורסים ירוקים כאשר נרגשים.

דרך נוספת להדגיש תכונה ספציפית עם פלואורסצנטיות היא לשלב את הקוד לחלבון פלואורסצנטי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP, לתוך ה- DNA של אורגניזם. הגן של GFP היה מבודד במקור ממדוזות וניתן לבטאו, או לייצר, על ידי תאים בתרבית בתגובה לגורמים ספציפיים או כחלק מסוג תא מסוים כמו תאי הגידול המוצגים זוהרים בתמונה זו

יישום נוסף של הדמיית פלואורסצנטיות הוא פלואורסצנטיות Speckle Microscopy שהיא טכנולוגיה המשתמשת במכלולים מקרומולקולריים בעלי תווית פלואורסצנטית כגון רשת F-actin הנראית כאן, כדי לחקור את התנועה ואת הקינטיקה המחזורית של חלבון ציטו-שלד חשוב זה.

טכניקה מתקדמת המכונה התאוששות פלואורסצנטית לאחר ההלבנה, או FRAP, מבוצעת על ידי בכוונה צילום אזור קטן של מדגם על מנת לפקח על קצב הדיפוזיה של מולקולות מתויג פלואורסצנטי בחזרה לאזור photoorescented בחזרה לתוך האזור מולבן.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב למיקרוסקופיית פלואורסצנטיות.

בסרטון זה למדנו על המושג פלואורסצנטיות, כיצד מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות שונה ממיקרוסקופיה קלה, וכיצד לקחת תמונת פלואורסצנטיות דרך הטווח. למדנו גם על כמה יישומים בסיסיים ומתקדמיים המשתמשים בפלואורסצנטיות. תודה שצפיתם ואל תשכחו בזמן שהלבנת תמונות נראית נהדר על השיניים, זה לא כל כך טוב לדגימות שלכם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter