Overview
Muitos experimentos biomédicos requerem manipulação de uma quantidade conhecida de células, a fim de alcançar dados precisos, reprodutíveis e estatisticamente relevantes. Portanto, aprender a contar células é uma técnica particularmente essencial para qualquer cientista biomédico bem sucedido. A maneira mais comum de contar células é usando um hemacítmetro - um instrumento que carrega duas grades gravadas a laser, que ajudam na enumeração de uma célula aliquot sob um microscópio de luz simples. Esses dados podem então ser usados para extrapolar o número de células em amostras experimentais.
Este vídeo mostrará como: ajustar a concentração experimental da amostra para que você não esteja tentando contar muitas – ou poucas – células; como usar um hemacítômetro para contar uma pequena alíquota (~10 μl) de células; como determinar qual quadrante da grade laser hemacítômetro usar para contagem; como calcular o número total de células em sua amostra experimental, dependendo do qual quadrante foi utilizado; e como determinar a viabilidade de sua população celular experimental usando a exclusão azul trypan. Além disso, também são discutidas várias situações experimentais para as quais é necessária uma determinação confiável e precisa dos números de células, incluindo um exemplo usando um contador automatizado de células.
Procedure
A contagem de células é um passo importante em muitos ensaios baseados em células para determinar o número e a viabilidade da célula. Em geral, o objetivo da contagem é entender o quanto uma amostra de uma concentração celular desconhecida deve ser diluída para uso posterior. A ferramenta de laboratório mais comum para contar células é o hemacytómetro.
O hemacítmetro é uma ferramenta de contagem que foi originalmente criada para contar células sanguíneas. No centro do hemacytômetro estão duas câmaras de contagem, sobre as quais uma grade gravada a laser pode ser encontrada.
A grade é composta por 9 quadrantes principais. Os quatro quadrantes de canto são ainda divididos em 16 quadrantes menores. O quadrante central é dividido em 25 desses quadrantes menores, cada um ainda dividido em 16 micro quadrantes.
Na extremidade mais distante de cada câmara estão as portas de introdução de amostras, nas quais a amostra celular a ser contada é dispensada.
Em ambos os lados das câmaras de contagem estão os suportes de montagem de deslizamento de cobertura, sobre os quais o deslizamento de quartzo repousa, geralmente cerca de 0,1 mm acima da câmara de contagem.
Como a área de cada quadrado grande é de 1 mm2, o volume contido por cada quadrado grande é de 0,1 mm3 ou 1/10.000 de um ml.
Antes de contar, sempre tire um momento para usar etanol e um kimwipe para limpar e secar qualquer fiapo, impressões digitais ou marcas d'água da tampa e da câmara de contagem.
Em seguida, adicione cuidadosamente uma pequena quantidade de água a cada um dos suportes de montagem de deslizamento de cobertura, a tensão superficial da água manterá a mancha no lugar.
Agora, triturar suavemente a suspensão da célula, ou pipetá-la para cima e para baixo, para desalojar qualquer aglomerado de células. Use uma micropipette para aspirar cerca de 10 μl da suspensão e, em seguida, carregar uma das portas de introdução com a amostra. A solução será atraída para a câmara de contagem por ação capilar e deve cobrir toda a grade.
Enquanto as células estão se acomodando, selecione o objetivo. Em seguida, coloque o hemacytómetro no palco.
Em seguida, veja as células sob o microscópio. Se houver menos de 5 células em cada um dos grandes quadrantes, você pode precisar girar sua amostra para baixo novamente e resuspensar a pelota em um volume menor. Se as células estão se sobrepondo ou são simplesmente densas demais para distinguir facilmente umas das outras, você pode precisar diluir sua amostra em um volume maior de solução. Certifique-se de acompanhar o fator com o qual você está diluindo suas células. Você vai precisar em um cálculo posterior.
Agora é hora de contar as células!
Como falamos anteriormente, a câmara de contagem está coberta por uma grade gravada a laser. As linhas dos quadrantes facilitam o controle das células que você está contando. Escolha o quadrante de tamanho para contar dependendo da densidade das células da sua amostra. Por exemplo, se houver um baixo número de células, conte todas as células em um dos quadrantes de canto. Para amostras com uma quantidade média de células, escolha um dos 16 quadrantes menores. Se houver uma densidade muito alta de células, conte as células em um dos 25 quadrantes centrais. Não importa qual quadrante você escolha ou a densidade da amostra celular, conte pelo menos 20-50 células por quarentena.
Nem todas as células cairão perfeitamente dentro dos quadrantes. Você pode contar as células que tocam as linhas superior e esquerda, mas desconsidere as que tocam na parte inferior ou direita. Para obter a contagem mais precisa, use um contador de células para acompanhar as células e pegue a média do número de células em 4 quadrantes do mesmo tamanho.
Para calcular o número de células em um volume de 1 ml, multiplique o número de células contadas em 10.000, pois, como mencionamos antes, cada quadrado grande na grade é 1/10.000 de um ml. Se você contou um desses quadrantes maiores, basta multiplicar este número 1. Se você contou um dos quadrados menores em um dos quadrantes de canto, multiplique este número por 16. Se você contou todas as células em um dos 25 quadrantes centrais, multiplique este número por 25. Se aconteceu de você diluir sua suspensão celular antes de carregar o hemacyotmetro, você também precisará multiplicar pelo fator de diluição.
Então, para calcular o número de células em 1 ml desta amostra, multiplicaríamos as 20 células neste quadrante central por 104 e 25 para obter um total de 5 x 106 células em 1 ml da amostra.
Agora que sabemos o número total de células em 1 ml da amostra, precisamos multiplicar esse número pelo volume total de nossa solução. Então, por exemplo, se tivermos 5 x 106 células em 1 ml, então em 2 ml, teremos um total de 1 x 107 células.
Em seguida, para evitar erros de contagem incorreta, distribuição irregular de células ou erros de pipetação, carregue o outro lado da câmara e conte sua amostra celular uma segunda vez.
Contar as células sob o microscópio também é um ótimo momento para avaliar a viabilidade das células em sua amostra. O azul trypan, uma mancha vital, é frequentemente misturado com a amostra antes de ser carregado no hemacytómetro para este fim.
As células vivas excluem esse corante, porque as células vivas são muito seletivas sobre o que permitem através de suas membranas. Uma célula morta, no entanto, não tem uma membrana intacta, o que permite que o azul trypan passe e manche o citoplasma.
Para verificar a viabilidade da amostra de sua célula, dilua uma alíquota da suspensão celular em azul trypan e, em seguida, carregue a amostra manchada azul trypan como a amostra celular regular. Sob o contraste de fase, as células vivas aparecerão brilhantes e douradas e devem ser contadas; não conte nenhuma das células azuis, mortas e maçante.
Calcule o número de células como antes, desta vez multiplicando o número final pelo fator de diluição azul trypan. Então, se nossa amostra representativa original tivesse sido diluída pela primeira vez em azul trypan, então teríamos multiplicado nosso número total de células por nossa diluição azul de 1:10 trypan, para um total de 1x108 células em nossa amostra.
Quando terminar de contar, lembre-se de limpar o tapa-cobertura e a câmara de contagem!
Agora que você é um profissional de contagem de células, vamos falar sobre algumas das razões que você pode precisar para saber quantas células você tem em um experimento particular.
Depois de isolar células de um tecido normal ou experimental, é importante saber quantas células você recuperou. Aqui os investigadores vão querer saber quantos esplenócitos, ou células de baço, eles se isolaram deste baço de rato.
Quando você está realizando um experimento para ver como duas populações de células diferentes reagem, é importante saber quantos de cada tipo de célula você está misturando, como neste experimento de co-cultura com células B e T.
Você vai querer saber quantas células você tem para muitos outros tipos de ensaios baseados em células. Aqui está sendo criado um ensaio elispot para determinar o número de células em uma amostra que secretará IFNγ, uma proteína inflamatória, em resposta ao vírus do papiloma humano.
Ao realizar um experimento no qual o mRNA precisa ser extraído, ou isolado, de suas células de interesse, é importante saber quantas chamadas você está começando, a fim de adquirir uma quantidade suficiente de mRNA para o experimento.
O hemacítômetro é uma ferramenta barata e relativamente fácil de usar para contar células, mas pode ser tedioso e tem potencial para erro humano.
O Scepter Handheld Automatic Counter é, como o nome indica, um dispositivo de contagem portátil que tem uma precisão de contagem melhorada em comparação com o hemacytómetro e que pode discriminar tanto o tamanho e o volume das células em uma amostra celular.
O contador automatizado de células TC10 avalia o número da célula e a viabilidade, calcula automaticamente o número total da célula em sua amostra e permite que as células sejam visualizadas em sua tela de leitura também.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à contagem de células. Neste vídeo revisamos: o que é um hemacytómetro, como contar células e determinar a viabilidade celular, e algumas razões diferentes que você pode precisar para contar células. Obrigado por assistir e lembre-se de não contar as células azuis!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
