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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

Le linee cellulari sono spesso utilizzate in esperimenti biomedici, in quanto consentono una rapida coltura ed espansione dei tipi di cellule per l'analisi sperimentale. Le linee cellulari vengono coltivate in condizioni simili rispetto alle cellule appena isolate o primarie, ma con alcune importanti differenze di base: (i) le linee cellulari richiedono i propri cocktail specifici di fattori di crescita e (ii) la loro crescita deve essere monitorata più da vicino rispetto alle cellule primarie, poiché le mutazioni che consentono loro di essere coltivate indefinitamente possono anche portare rapidamente alla loro crescita eccessiva. Pertanto, quando una linea cellulare raggiunge il punto di crescita in coltura in cui copre la maggior parte del fondo del contenitore di coltura, o circa un 90% di confluenza,le cellule devono essere risuscise, lavate, utilizzate sperimentalmente, congelate per un uso successivo o nuovamente seminate per un'ulteriore espansione in nuovi contenitori di coltura.

Questo video dimostrerà come utilizzare gli indicatori dei supporti per determinare la salute della coltura cellulare, quali reagenti e attrezzature sono utili per rimuovere in modo sicuro le linee cellulari aderenti dalla coltura e verranno discussi vari metodi per trasferire queste cellule in forte espansione in nuove colture. Sono stati inoltre dimostrati i metodi su come colturare le cellule di alimentazione (importanti per fornire fattori di crescita essenziali alle linee cellulari) e come espandere un gran numero di colture di linee cellulari contemporaneamente.

Procedure

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Il passaggio, o subculturazione, delle cellule è una procedura comune in cui le cellule di una determinata coltura vengono divise, o "divise", in nuove colture e alimentate con mezzi freschi per facilitare un'ulteriore espansione. Mentre il concetto stesso è relativamente semplice, in questo video discuteremo alcuni dei passaggi più importanti per il successo della manutenzione e dell'espansione delle linee cellulari.

I metaboliti tossici si accumulano nei mezzi di coltura cellulare nel tempo. Quando si espandono le cellule, è particolarmente importante cambiare regolarmente i mezzi per mantenere la salute cellulare e monitorare l'espansione cellulare per evitare la crescita eccessiva delle cellule.

Generalmente, due tipi principali di cellule sono sottocolte: linee cellulari immortalizzate e linee di cellule staminali

Le linee cellulari immortalizzate sono cellule derivate da organismi multicellulari che hanno sperimentato un qualche tipo di mutazione che influenza la regolazione del ciclo cellulare, consentendo loro di proliferare indefinitamente. Forse la linea cellulare immortalata più famosa è la linea cellulare HeLa, che è stata derivata da una lesione del cancro cervicale trovata su una biopsia presa dalla signora Henrietta Lacks nel 1951.

A differenza delle linee cellulari immortalate dal cancro, le linee di cellule staminali sono generate isolando cellule auto-rinnovanti e multipotenti da una varietà di tessuti sia da tessuti adulti che embrionali. Nelle giuste condizioni queste cellule, come le cellule staminali embrionali umane che vedete qui, possono essere mantenute in coltura a tempo indeterminato.

Le cellule sono coltivate in modo ottimale in sospensione, come le cellule immortalizzate isolate dal sangue, o crescono meglio se aderiscono a una superficie, come nel caso di molte cellule derivate dai tessuti.

La crescita di queste cellule aderenti deve essere attentamente monitorata per garantire la salute delle cellule. A seconda del tipo di cellula, la maggior parte delle cellule aderenti deve essere attraversata quando sono confluenti al 70-90%, cioè quando coprono il 70-90% della superficie del contenitore di coltura.

Tieni presente che le linee cellulari mantengono molte caratteristiche della coltura cellulare originale, ma con ogni passaggio successivo possono anche iniziare ad acquisire caratteristiche uniche per la coltura espansa. Pertanto, considera di limitare il numero di volte in cui continui a passare una singola coltura cellulare.

Quando si passano le cellule, è importante utilizzare la tecnica sterile e i reagenti e le attrezzature appropriati.

È essenziale utilizzare i mezzi appropriati per la crescita e l'espansione ottimali della linea cellulare. Ogni linea cellulare richiederà un cocktail specifico di integratori per la crescita, tuttavia, la maggior parte delle linee cellulari richiede almeno l'integrazione con quanto segue: Siero, come il siero bovino fetale, che deve essere trattato termicamente per inattivare il complemento bovino e che fornisce fattori di crescita vitali per le cellule, antibiotici, come penicillina e streptomicina, che aiutano a limitare la crescita contaminante nella coltura, e altri fattori di crescita, come il fattore di crescita dei fibroblasti, per aiutare a prolungare la crescita e l'espansione delle linee cellulari. Conservare il supporto di coltura cellulare integrato, o "completo", a 4 C quando non lo si utilizza.

Innanzitutto, prendi nota del colore dei mezzi di coltura dei tessuti. I mezzi di coltura cellulare freschi sono ricchi di sostanze nutritive e appaiono di un colore arancione chiaro, in parte dovuto all'aggiunta dell'indicatore di pH, il rosso fenolo.

Quando le cellule iniziano a consumare sostanze nutritive nei mezzi, i rifiuti e l'acido iniziano ad accumularsi nella coltura cellulare, abbassando il pH. Per questo motivo, molti mezzi di coltura tissutale contengono rosso fenolo, che trasforma il mezzo da arancione a giallo quando le cellule trasformano la coltura acida. Cambia il supporto prima che diventi di questo colore!

Quando il rosso fenolo trasforma il media in un colore rosato, indicando che il pH è diventato troppo semplice per una crescita cellulare sana, potrebbe essere il momento di cambiare il serbatoio di CO2 e il supporto.

La maggior parte delle linee cellulari aderenti si attaccano naturalmente alla plastica non rivestita. Pertanto le piastre di coltura cellulare in plastica, come le piastre di Petri o 6 piastre di pozzo, sono spesso utilizzate per la sottoculturazione delle cellule.

Vengono utilizzati anche palloni di coltura cellulare in plastica. Il pallone per colture cellulari T25, ad esempio, viene spesso utilizzato per espandere le popolazioni di piccole linee cellulari o per avviare la crescita di una linea cellulare in lenta espansione. I palloni di coltura T75 sono comunemente usati per le linee cellulari che proliferano più rapidamente o per generare un numero maggiore di cellule rispetto a quelle che possono stare in un pallone T25.

Quando si rimuovono le cellule aderenti, le proteine che legano le cellule alla plastica devono prima essere scisse. A tale scopo, l'enzima digestivo tripsina viene spesso utilizzato. È importante cronodare attentamente l'esposizione alla tripsina, poiché il trattamento per troppo tempo può causare danni ad altre proteine della superficie cellulare.

I mezzi di coltura cellulare possono contenere neutralizzatori di tripsina. Pertanto, la soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, viene spesso utilizzata per lavare le cellule prima della tripsinizzazione.

EDTA, un chelatore di calcio, è talvolta utilizzato anche per migliorare la funzione proteolitica della tripsina.

Per l'espansione della colonia cellulare, le cellule appena attraversate vengono quindi coltivate in un incubatore di colture cellulari nelle condizioni appropriate a quella linea cellulare, in genere a circa 37 C, 5% di CO2 e 95% di umidità.

Prima di iniziare, è importante capire con quale frequenza le cellule devono essere monitorate, il che dipenderà dalla velocità con cui le cellule proliferano.

Ora che il tuo supporto è di un colore arancione felice, osserva le altre condizioni di coltura, come ad esempio se la coltura è torbosa o meno - possibilmente indicando contaminazione - la dimensione e la densità delle colonie cellulari e la qualità complessiva delle cellule.

Se le cellule hanno raggiunto circa il 90% di confluenza, rimuovere il mezzo di coltura tissutale e lavare le cellule con PBS privo di calcio e magnesio.

Ora aggiungi la tripsina alle cellule e poi incubale a 37 C. Dopo circa 5 minuti, confermare che le cellule si sono staccate e quindi interrompere la proteolisi aggiungendo mezzi di coltura tissutale freschi.

Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico per la centrifugazione. Quindi, dopo aver ruotato le cellule, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet e risospenare le cellule in mezzi freschi. Conta quante cellule hai raccolto e poi semina le cellule in base alla densità appropriata per l'espansione immediata o successiva.

Ora che sai come passare le cellule, diamo un'occhiata ad alcune diverse applicazioni del metodo.

Come accennato in precedenza, le cellule staminali embrionali umane sono un tipo di cellula che deve essere attraversata. Sono tipicamente cocolti con fibroblasti embrionali di topo, o MEF, che forniscono fattori che aiutano le cellule staminali a mantenere il loro stato pluripotente.

Le colonie di cellule staminali cresciute su cellule di alimentazione devono essere "raccolte" una volta raggiunto il giusto stadio di sviluppo. Possono essere selezionati mediante micropipetta o raschiando delicatamente con uno strumento di raccolta del vetro e quindi placcati in una nuova cultura per l'espansione.

Alcune linee cellulari sono sensibili alla digestione enzimatica o sono così strettamente aderenti che non possono essere riconsocie con il solo trattamento con tripsina. Un raschietto cellulare può essere utilizzato per rimuovere delicatamente le cellule dal fondo della piastra di coltura. Se le cellule sono particolarmente aderenti, provare a spostare una pipetta sierologica con un movimento raschiante deciso mentre si risciacqua il fondo del contenitore cellulare con un supporto o un'altra soluzione appropriata. Fai attenzione con questo metodo, poiché le cellule delicate possono essere danneggiate da questo metodo meccanico di dissociazione.

Per aumentare l'espansione delle cellule in modo più rapido e riproducibile di quanto si possa ottenere nei palloni a strato singolo, è possibile utilizzare palloni multistrato, che possono espandere le colture cellulari di 3-5 volte rispetto ai palloni a strato singolo.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alle cellule che passano. In questo video abbiamo esaminato cos'è una linea cellulare, come sottocultarne una e alcune diverse applicazioni delle cellule di passaggio. Grazie per aver guardato e ricordati di mantenere freschi i tuoi media!

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