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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

As linhas celulares são frequentemente utilizadas em experimentos biomédicos, pois permitem a rápida cultura e expansão de tipos celulares para análise experimental. As linhas celulares são cultivadas em condições semelhantes quando comparadas a células recém-isoladas, ou primárias, mas com algumas diferenças importantes básicas: (i) as linhas celulares requerem seus próprios coquetéis específicos de fator de crescimento e (ii) seu crescimento deve ser mais monitorado do que as células primárias, já que as mutações que permitem que elas sejam cultivadas indefinidamente também podem levar rapidamente ao seu crescimento excessivo. Portanto, quando uma linha celular atinge o ponto de crescimento da cultura, onde cobre a maior parte do fundo do recipiente de cultura, ou cerca de 90% de confluência,as células devem ser resuspended, lavadas, usadas experimentalmente, congeladas para uso posterior ou re-semeadas para expansão em novos recipientes culturais.

Este vídeo demonstrará como usar indicadores de mídia para determinar a saúde da cultura celular, quais reagentes e equipamentos são úteis para remover com segurança linhas celulares aderentes da cultura, e vários métodos para transferir essas células em expansão robusta para novas culturas serão discutidos. Também são demonstrados métodos de como cultivar células alimentadores (importantes para fornecer fatores essenciais de crescimento às linhas celulares) e como expandir um grande número de culturas de linhas celulares ao mesmo tempo.

Procedure

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A passagem, ou subculturação, de células, é um procedimento comum em que as células de uma determinada cultura são divididas, ou "divididas", em novas culturas e alimentadas com novas mídias para facilitar a expansão. Embora o conceito em si seja relativamente simples, neste vídeo discutiremos alguns dos passos mais importantes para a manutenção e expansão bem sucedidas das linhas celulares.

Metabólitos tóxicos se acumulam na mídia de cultura celular ao longo do tempo. Ao expandir as células, é particularmente importante mudar a mídia regularmente para manter a saúde celular e monitorar a expansão celular para evitar o crescimento excessivo das células.

Geralmente, dois tipos principais de células são subculturadas: linhas celulares imortalizadas e linhas de células-tronco

Linhas celulares imortalizadas são células derivadas de organismos multicelulares que experimentaram algum tipo de mutação afetando sua regulação do ciclo celular, permitindo que elas se proliferem indefinidamente. Talvez a linha celular imortalizada mais famosa seja a linha celular HeLa, que foi derivada de uma lesão de câncer cervical encontrada em uma biópsia tirada da Srta. Henrietta Lacks em 1951.

Em contraste com as linhas celulares imortalizadas pelo câncer, as linhas de células-tronco são geradas por células autoconexadoras e multipotentes isoladas de uma variedade de tecidos, tanto de tecidos adultos quanto embrionários. Sob as condições certas, essas células, como as células-tronco embrionárias humanas que você vê aqui, podem ser mantidas na cultura indefinidamente.

As células são cultivadas de forma ideal em suspensão, como células imortalizadas isoladas do sangue, ou crescem melhor quando aderidas a uma superfície, como é o caso de muitas células derivadas de tecidos.

O crescimento dessas células aderentes deve ser acompanhado de perto para garantir a saúde celular. Dependendo do tipo celular, a maioria das células aderentes precisa ser passagem quando são 70-90% confluentes, ou seja, quando cobrem 70-90% da superfície do recipiente de cultura.

Tenha em mente que as linhas celulares retêm muitas características da cultura celular original, mas a cada passagem sucessiva elas também podem começar a adquirir características exclusivas da cultura expandida. Portanto, considere limitar o número de vezes que você continua a passar por uma cultura celular individual.

Ao passar células, é importante usar a técnica estéril e os reagentes e equipamentos apropriados.

É essencial usar as mídias apropriadas para o crescimento e expansão ideal da sua linha celular. Cada linha celular exigirá um coquetel específico de suplemento de crescimento, no entanto, a maioria das linhas de células no mínimo requerem suplementação com o seguinte: Soro Bovino Fetal, que deve ser tratado a calor para inativar o complemento bovino e que fornece fatores vitais de crescimento para as células, antibióticos, como penicilina e estreptomicina, que ajudam a limitar a contaminação do crescimento na cultura, e outros fatores de crescimento, como o fator de crescimento do fibroblasto, para ajudar a prolongar o crescimento e a expansão das linhas celulares. Armazene a mídia de cultura celular complementada ou "completa" a 4 C quando você não estiver usando.

Primeiro, tome nota da cor da mídia da cultura tecidual. A mídia fresca da cultura celular é rica em nutrientes e parece uma cor clara e laranja, em parte devido à adição do indicador de pH, vermelho fenol.

À medida que as células começam a usar nutrientes na mídia, o desperdício e o ácido começam a se acumular na cultura celular, diminuindo o pH. Por essa razão, muitas mídias de cultura de tecidos contêm fenol vermelho, o que torna a mídia de laranja para amarelo quando as células tornam a cultura ácida. Mude a mídia antes que vire essa cor!

Quando o vermelho fenol transforma a mídia em uma cor rosada, indicando que o pH se tornou muito básico para o crescimento saudável das células, talvez seja hora de mudar seu tanque de CO2, bem como sua mídia.

A maioria das linhas de células aderentes se conectam naturalmente ao plástico não revestido. Portanto, placas de cultura de células plásticas, como placas de petri ou 6 placas de poço, são frequentemente usadas para subculturar células.

Frascos de cultura de células plásticas também são usados. O frasco de cultura celular T25, por exemplo, é frequentemente usado para expandir populações de pequenas linhas celulares ou para iniciar o crescimento de uma linha celular em expansão lenta. Frascos de cultura T75 são comumente usados para linhas celulares que se proliferam mais rapidamente ou para gerar um número maior de células do que pode caber em um frasco T25.

Ao remover células aderentes, as proteínas que ligam as células ao plástico devem primeiro ser cortadas. Para isso, a trippsina da enzima digestiva é frequentemente utilizada. É importante cronometrar cuidadosamente a exposição à trippsina, pois o tratamento por muito tempo pode resultar em danos a outras proteínas da superfície celular.

A mídia de cultura celular pode conter neutralizadores de trippsina. Portanto, o soro fisiológico tamponado de fosfato, ou PBS, é frequentemente usado para lavar as células antes da experimentação.

EDTA, um querador de cálcio, às vezes também é usado para melhorar a função proteolítica da trippsina.

Para a expansão da colônia celular, as células recém-passagem são cultivadas em uma incubadora de cultura celular sob as condições apropriadas para essa linha celular, tipicamente a cerca de 37 C, 5% de CO2 e 95% de umidade.

Antes de começar, é importante entender com que frequência suas células devem ser monitoradas, o que dependerá da rapidez com que suas células se proliferam.

Agora que sua mídia é uma cor laranja feliz, observe as outras condições culturais, como se a cultura é ou não nebulosa – possivelmente indicando contaminação -- o tamanho e a densidade das colônias celulares, e a qualidade geral das células.

Se as células atingirem cerca de 90% de confluência, remova a mídia de cultura tecidual e lave as células com PBS livre de cálcio e magnésio.

Agora adicione trippsina às células e, em seguida, incuba-las a 37 C. Após cerca de 5 minutos, confirme que as células se separaram e, em seguida, pare a proteólise adicionando mídia de cultura de tecido fresco.

Transfira a suspensão celular para um tubo cônico para centrifugação. Então, depois de girar as células, remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota e resuspense as células em mídia fresca. Conte quantas células você coletou e depois semeou as células de acordo com a densidade apropriada para expansão imediata ou posterior.

Agora que você sabe como passar células, vamos olhar para algumas aplicações diferentes do método.

Como mencionado anteriormente, as células-tronco embrionárias humanas são um tipo de célula que deve ser passagem. Eles são tipicamente coculturados com fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs, que fornecem fatores que ajudam as células-tronco a manter seu estado pluripotente.

Colônias de células-tronco cultivadas em células alimentados precisam ser "escolhidas" uma vez que atingiram o estágio adequado de desenvolvimento. Eles podem ser selecionados por micropipette ou por raspagem suave com uma ferramenta de colheita de vidro e, em seguida, banhados em uma nova cultura de expansão.

Algumas linhas celulares são sensíveis ao digestor enzimático ou são tão firmemente aderentes que não podem ser resuspended apenas com o tratamento de trippsina. Um raspador de células pode ser usado para remover suavemente as células da parte inferior da placa de cultura. Se as células forem particularmente aderentes, tente mover uma pipeta sorológica em um movimento de raspagem firme enquanto enxagua o fundo do recipiente celular com mídia ou outra solução apropriada. Tome cuidado com este método, pois células delicadas podem ser danificadas por este método mecânico de dissociação.

Para escalar mais rapidamente e reprodutivelmente a expansão de suas células do que pode ser alcançado em frascos de camada única, frascos multicamadas, que podem expandir culturas celulares 3-5 vezes em comparação com frascos de camada única, podem ser usados.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE às células de passagem. Neste vídeo revisamos o que é uma linha celular, como subcultura e algumas aplicações diferentes de células passantes. Obrigado por assistir e lembre-se de manter sua mídia fresca!

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