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PCR: La reazione a catena della polimerasi

Overview

La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica utilizzata per amplificare il DNA attraverso il termociclizzazione – cicli di variazioni di temperatura a intervalli di tempo fissi. Utilizzando una DNA polimerasi termostabile, la PCR può creare numerose copie di DNA da blocchi di costruzione del DNA chiamati dNTP. Ci sono tre passaggi nella PCR: denaturazione, ricottura e allungamento. La denaturazione è il primo passo del ciclo e fa sì che il DNA si sciolga interrompendo i legami idrogeno tra le basi con conseguente DNA a singolo filamento. La ricottura abbassa la temperatura abbastanza da consentire il legame dei primer oligonucleotidici al modello di DNA. Durante la fase di allungamento la DNA polimerasi sintetizza nuovo DNA a doppio filamento.

Questo video fornisce un'introduzione alla procedura PCR. Vengono descritti i principi di base della PCR e una procedura passo-passo per l'impostazione di una reazione PCR generalizzata. Il video mostra i componenti necessari per una reazione PCR, include istruzioni per la progettazione del primer e fornisce suggerimenti utili per garantire reazioni PCR di successo.

Procedure

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La reazione a catena della polimerasi o PCR è un metodo ampiamente utilizzato per amplificare i frammenti di DNA. La PCR utilizza il termociclo, che è il riscaldamento e il raffreddamento ripetuti della reazione attraverso tre temperature distinte chiamate denaturazione, ricottura ed estensione o allungamento.

La reazione di termociclica inizia una volta che i reagenti PCR vengono messi in un termociclatore una macchina, che è programmata per riscaldare e raffreddare con precisione la reazione.

Il ciclo PCR inizia con la denaturazione, che si verifica per 20-30 secondi a 95 °C, ben al di sopra della temperatura di fusione del DNA. La temperatura di fusione è uno stato in cui metà del DNA è un'elica a doppio filamento e l'altra è una bobina casuale a singolo filamento. La temperatura di denaturazione è ben al di sopra della temperatura di fusione, al fine di garantire che tutti i legami idrogeno tra coppie di basi complementari siano rotti producendo solo DNA a singolo filamento. I singoli fili accoppiati sono chiamati fili di senso e antisenso. La sequenza del senso, o filamento codificante, è identica alla sequenza di mRNA, che alla fine codificherà per la proteina. Pertanto, ha senso. Se letto da sinistra a destra inizia con il fosfato 5' e termina con l'idrossile 3'. Il filamento antisenso è anche chiamato filamento complementare e inizia con 3' idrossile e termina con il fosfato 5' quando letto da sinistra a destra.

Nella seconda fase, la ricottura, brevi pezzi di DNA chiamati primer, che sono specifici per il senso o i filamenti antisenso si legano tramite legami idrogeno. Il primer che si lega al filo antisenso e ha la stessa sequenza del filamento di senso è il primer in avanti o di senso. Il primer che si lega al filamento di senso e ha una sequenza inversa e complementare al filamento di senso è il tuo primer inverso o antisenso. A seconda della lunghezza dei primer utilizzati, la temperatura di ricottura per questa fase è solitamente da 3 a 5 °C al di sotto della temperatura di fusione inferiore dei due primer. La ricottura tende a verificarsi tra 50 e 65 °C e dura da 20 a 40 secondi.

Una volta che i primer si legano al DNA innescano la reazione creando un'estremità del gruppo ossidrile 3' a cui si legherà una polimerasi, un enzima che replica il DNA.

Il passo successivo chiamato allungamento o estensione si verifica a 72 ° C, che è ottimale per l'attività della polimerasi. Una volta legata la polimerasi inizia ad aggiungere nucleotidi trifosfati liberi, o dNTP, alle estremità del primer una alla volta nella direzione da 5' a 3' per produrre DNA a doppio filamento.

Una volta completato l'allungamento, inizia il ciclo successivo. Nel ciclo successivo i primer si legheranno al DNA a singolo filamento formato tramite precedente estensione. Il frammento corto che stai cercando di amplificare, l'amplicone, alla fine si formerà quando la polimerasi si estende dal primer in avanti su un filo che è stato generato dall'amplificazione dal primer inverso o viceversa. Una volta generato, la quantità di amplicon aumenterà esponenzialmente nei cicli successivi. A seconda dell'obiettivo della tua reazione, saranno necessari da 20 a 40 cicli.

Per gli ampliconi lunghi, una fase finale di allungamento viene in genere eseguita a 72 °C per 5-15 minuti al fine di garantire che tutto il DNA sia a doppio filamento. Di solito, una fase di attesa finale a 4 °C viene programmata nel termociclatore come misura precauzionale per garantire che il DNA rimanga stabile fino a quando non viene tolto dal termociclatore.

La reazione PCR richiede diversi reagenti chiave. Il primo è il modello di DNA, che è il campione di DNA da cui il tuo frammento sarà amplificato. Poi ci sono i tuoi primer, che sono i brevi pezzi di DNA o oligonucleotidi che innescano la reazione della polimerasi.

Ci sono diverse considerazioni importanti che devono essere prese quando si scelgono i primer. In primo luogo, devono essere complementari alle regioni 5' e 3' del tuo modello di DNA che affiancano la sequenza che vuoi amplificare. In secondo luogo, dovrebbero essere lunghi tra 15 e 30 coppie di basi ed essere composti da circa il 50% di guanine e citosine. In terzo luogo, le temperature di fusione di entrambi i primer devono essere superiori a 50 °C e a uno o due gradi l'una dall'altra in modo che possano legarsi in modo efficiente alla stessa temperatura di ricottura. In quarto luogo, non possono essere complementari tra loro e formare dimeri di primer. E quinto, non dovrebbero contenere una struttura secondaria, che si forma per auto-ricottura all'interno di uno dei primer.

Oltre ai primer e al modello di DNA, la DNA polimerasi è essenziale per la reazione PCR. L'enzima più comunemente usato nella PCR è la Taq polimerasi, che è un enzima termostabile isolato dal batterio Thermus aquaticus che fa la sua casa nelle sorgenti termali. La taq polimerasi può resistere a temperature superiori a 90 °C.

Anche i dNTP, che comprenderanno le coppie di basi nei fili in crescita, devono essere aggiunti alla reazione. Un tampone di reazione, che mantiene il pH e contiene ioni importanti come manganese, magnesio e potassio, è anche un componente di reazione necessario che stabilizza la reazione e fornisce importanti cofattori all'enzima polimerasi. Come tutte le reazioni, la PCR ha bisogno di un solvente, e quindi viene utilizzata acqua di grado PCR, che è priva di ioni che possono inibire la reazione.

Prima di iniziare la PCR assicurarsi che l'ambiente di lavoro sia pulito per evitare contaminazioni. I guanti devono essere sempre indossati.

Per aiutarti a tenere traccia dei vari componenti di reazione di cui avrai bisogno. Crea una tabella dei volumi e delle concentrazioni dei reagenti per ciascuno dei tuoi campioni, inclusi i controlli. In termini di volumi una reazione tipica dovrebbe contenere 5μL di tampone di reazione 10X, 4μL di 25 mM MgCl2, 1μL di dNTP a 10 mM, 2μL di primer avanti e indietro a 50 ng/μL e 0,3μL di Taq polimerasi a 5 U/μL. Si desidera aggiungere un modello sufficiente in modo che 100 ng sia presente nella reazione. Infine, la maggior parte delle reazioni PCR sono condotte in un volume totale di 50μL. Quindi un volume di acqua di grado PCR deve essere utilizzato per garantire che il volume totale sia effettivamente di 50 μL.

Una volta che la tua reazione è pianificata su carta, assembla i tuoi reagenti sul ghiaccio.

Quindi, aggiungere i reagenti al tubo PCR. Per prima cosa aggiungi acqua, poi il tuo modello, i tuoi primer, tampone, cloruro di magnesio e dNTPs, aggiungi Taq polimerasi per ultimo e mescola accuratamente.

Dopo aver impostato la reazione, posizionare il campione in un termociclatore e avviare il programma PCR. In breve, le parti della macchina sono costituite da un termoblocco, in cui viene inserito il tubo o la piastra PCR e soggetto a precisi sminamento. Un coperchio riscaldato, che impedisce la condensa in modo da non perdere alcun campione e un'interfaccia con un display per la programmazione delle temperature PCR e delle durate del ciclo. Impostare sempre il programma prima di assemblare la reazione.

Una volta che il termociclatore ha fatto il suo lavoro. Eserite la vostra reazione e verificate il prodotto PCR con l'elettroforesi su gel. Se la PCR ha successo, dovresti vedere l'amplicon alla dimensione corretta della coppia di basi.

E ora per alcuni suggerimenti utili quando si lavora con la PCR. Quando si sta cercando di amplificare lo stesso prodotto PCR da una serie di modelli diversi e quindi avere molte reazioni diverse alla configurazione. È utile aumentare la reazione per creare un mix principale. La miscela master PCR è una miscela di grande volume di tutti i reagenti condivisi tra i campioni, che viene successivamente distribuita in più provette di reazione.

La maggior parte delle reazioni PCR inizia con una fase iniziale di denaturazione, che si verifica a 95 ° C per 1-9 minuti. Questo passaggio garantisce che tutto il modello sia a singolo filamento per il primo ciclo di amplificazione.

Spesso è preferibile utilizzare un armadio PCR quando il rischio di contaminare il campione è elevato. Per verificare la ricerca di eventuali contaminazioni nella tua reazione è utile impostare un controllo negativo, che non ha un modello di DNA e non dovrebbe produrre un prodotto nel tuo gel di DNA.

Spesso la PCR deve essere ottimizzata regolando le temperature, la concentrazione di cloruro di magnesio o provando nuovi primer. Una volta che hai la tua PCR funzionante. È una buona idea eseguire sempre un modello di controllo positivo, che sai produrrà un prodotto.

Esistono molte varianti e applicazioni della PCR per una varietà di scopi.

Una variante della PCR, la PCR ad avvio caldo, comporta il trattenemento della polimerasi dalla reazione fino a dopo la prima fase di denaturazione, che impedisce l'amplificazione non specifica che potrebbe verificarsi prima del ciclo.

La PCR può anche essere modificata per amplificare simultaneamente più sequenze di DNA impiegando più primer in una singola reazione PCR chiamata multiplex PCR.

In combinazione con sonde oligonucleotidiche fluorescenti, la PCR può effettivamente diventare una tecnica in grado di misurare i livelli relativi o assoluti di espressione genica o la quantità di mRNA prodotta per un determinato gene o gruppo di geni. Questo metodo è indicato come qPCR.

La PCR può anche essere utilizzata per determinare la presenza di una particolare sequenza di DNA in un organismo. Questa procedura è indicata come genotipizzazione. Ad esempio, la genotipizzazione può essere utilizzata per determinare l'autenticità dei campioni di pesce cercando di capire se nel campione è presente una sequenza specifica della specie. La genotipizzazione viene anche utilizzata nell'analisi forense per determinare se il DNA trovato sulla scena di un crimine corrisponde a un sospetto.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla PCR. In questo video abbiamo esaminato cos'è la PCR e come funziona, i molti componenti della reazione PCR, il meccanismo con cui la PCR può amplificare il DNA e le molte variazioni e applicazioni di questa tecnica molto utile. Grazie per l'attenzione!

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