Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

הפרדת חלבון עם SDS-PAGE

Overview

נתרן דודסיל סולפט פולי-אקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה, או SDS-PAGE, היא טכניקה נפוצה להפרדת תערובות של חלבונים בהתבסס על גודלם ולא שום דבר אחר. SDS, חומר ניקוי אניוני, משמש לייצור מטען אחיד לאורך חלבונים שהיו ליניאריים. על ידי טעינתם תחילה לתוך ג'ל עשוי polyacrylamide ולאחר מכן החלת שדה חשמלי על הג'ל, חלבונים מצופים SDS מופרדים לאחר מכן. השדה החשמלי משמש ככוח המניע, ומושך את החלבונים מצופים SDS לכיוון האנודה עם חלבונים גדולים יותר הנעים לאט יותר מחלבונים קטנים. על מנת לזהות חלבונים לפי גודל, תקני חלבון בגודל ידוע נטענים יחד עם דגימות ומפעלים באותם תנאים.

סרטון זה מציג מבוא ל- SDS-PAGE על ידי הסבר תחילה התיאוריה שמאחוריו ולאחר מכן הדגמת הליך שלב אחר שלב שלה. פרמטרים ניסיוניים שונים, כגון ריכוז polyacrylamide ומתח להחיל על הג'ל נדונים. שיטות הכתמה במורד הזרם כמו Coomassie וכתמי כסף מוצגים, וריאציות של השיטה, כמו אלקטרופורזה ג'ל 2D מוצגים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SDS-PAGE היא טכניקה המשמשת חוקרים רבים להפרדת תערובות של חלבונים לפי גודל. השלמה מוצלחת של טכניקה זו היא צעד ראשון חיוני עבור שיטות רבות של ניתוח חלבון, כמו אימונובלוטינג. כשלעצמו, זהו כלי שימושי בהערכת גודל החלבון והטוהר.

כדי להבין את טכניקת SDS-PAGE, עליך להבין תחילה את מרכיביה העיקריים. SDS-PAGE מייצג נתרן דודסיל סולפט פולי-אקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה. נתרן-דודציל סולפט, החלק הראשון של זה, או "SDS", הוא חומר ניקוי אניוני. משמעות הדבר היא כי הוא מורכב מקבוצה הידרופילית עם מטען שלילי נטו שרשרת שרשרת הידרופובית ארוכה עם מטען נייטרלי.

השרשרת ההידרופובית מכסה חלבונים ביחס למסה שלהם בקצב של 1.4 גרם SDS לגרם חלבון. זה מספק את החלבונים עם הכוח המניע הדרוש להפרדה מונעת גודל בשדה חשמלי.

אלקטרופורזה ג'ל פולי-אקרילאמיד משתמש בהידרוג'ל העשוי מפוליאקרילמיד. Polyacrylamide הוא פולימר היוצר מטריצה רגילה מאוד שדרכה חלבונים יכולים לנוע. ככל שהג'ל מרוכז יותר, כך החלבונים יחצו אותו לאט יותר כאשר הם נחשפים לשדה חשמלי. תהליך השימוש בשדה חשמלי אחיד מרחבי כדי להשפיע על תנועת אובייקטים ידוע בשם אלקטרופורזה.

SDS-PAGE מבוצע על חלבונים מבודדים ממקורות רבים ושונים כולל תאים בתרבית, רקמות, דם, שתן ושמרים.

חלבונים ממקורות שונים אלה חייבים להיות מופרדים תחילה מרכיבים תאיים אחרים באמצעות טכניקות כולל הומוגניזציה וצנטריפוגה, לעתים קרובות ואחריו השימוש במאגרי תמוגה.

ברגע שהחלבון מבודד, הריכוז שלו נמדד לעתים קרובות, כדי להבטיח טעינה שווה של דגימות, על ידי השוואת כמות החלבון במדגם לתקני אלבומין בחומצה בינצ'ונינית, או BCA, בדיקה צבעונית.

שלב חשוב לזכור הוא הוספת מאגר הטעינה. למאגר הטעינה יש 3 פונקציות עיקריות. ראשית, הודות ל- SDS וסוכני הפחתת נוספים, הוא מצמצם את החלבונים, מה שאומר בעצם שהוא הופך מבני חלבון מורכבים לשרשרת ליניארית של חומצות אמינו. שנית, הוא מכיל גליצרין, אשר מבטיח כי המדגם לא לצוף משם כאשר הוא טעון בבארות של הג'ל. ולבסוף, רוב מאגרי הטעינה המסחריים כוללים צבע, כגון ברומופנול כחול, אשר ניתן לעקוב אחר כדי למדוד את ההתקדמות של שלב אלקטרופורזה.

לאחר הוספת מאגר הטעינה, הדגימות צריך להיות מעורב ולאחר מכן מבושל במשך 5 דקות. זה מאפשר את קשרים די-גופרתיים חזקים חלבונים להיות שבור בעזרת סוכן הפחתת כגון בטא mercaptoethanol. ברגע שכל קשרי הדיסולפידים שבורים SDS יכול לצפות באופן שווה יותר את החלבונים.

לאחר מכן, הדגימות מסובבות במהירות למטה ואז מוכנות להעמיס לתוך מערכת הג'ל עבור אלקטרופורזה.

לפני שניתן יהיה לטעון את הדגימות, יש להרכיב תחילה את מערכת הג'ל. זה מתחיל ברכישה או ייצור של ג'ל פוליאקרילמיד. ג'לים מוכנים מראש הופכים יותר ויותר פופולריים כי אקרילימיד הוא neurotoxic והוא יכול לגרום נזק מוחי. קלטת הג'ל מכילה בארות המשמשות לטעינת הדגימות.

לאחר הג'לים מאובטחים במקום, החדרים הפנימיים והחציוניים מלאים במאגר המכיל את אותו ריכוז של יונים המשמשים להכנת הג'לים. זה יוצר מעגל חשמלי שעובר בצורה חלקה מהקתודה, דרך הג'ל אל האנודה.

לאחר מכן, סולמות משקל מולקולריים נטענים בדרך כלל לתוך הג'ל, ואחריו הדגימות. כמו הג'ל פועל, הסולם יתפשט וליצור רצועות חלבון גלויות בגדלים ידועים. בשלבים האחרונים, רצועות אלה יכולות לשמש לחישוב גודלו של כל חלבון.

לאחר כל הדגימות נטענות, המסופים החיוביים והשליליים על קופסת הג'ל מחוברים למקור כוח המסוגל לשמור על מתח קבוע במשך תקופה ארוכה של זמן. ג'לים מתחילים בדרך כלל בסביבות 60V עד המדגם כולו נכנס לאזור הג'ל שנקרא "ג'ל לערום". לאחר מכן, המתח גדל לסביבות 200V במשך 30 דקות עד שעה אחת בהתאם לגודל וריכוז של הג'ל ואת גודל החלבון של עניין.

כאשר האלקטרופורזה הושלמה, הקלטת מוסרת ונפתחת כדי לחשוף את הג'ל. לאחר מכן ניתן להכתים את הג'ל בכתם חלבון טיפוסי, כגון כחול קומאסי או כתם כסף, כדי לדמיין את רצועות החלבון בתוך הג'ל. כתם קומאסי יכול לזהות רצועות עם מעט כמו 50 ננוגרם של חלבון, בעוד כתם כסף יכול לזהות רצועות עם מעט כמו 1 ננוגרם של חלבון.

באלקטרופורזה ג'ל דו-ממדית, הדגימות מופרדות על ידי שני מאפיינים נפרדים על ג'לים, ממד אחד בכל פעם. ראשית, דגימות נטענות ומסודרות על פי הנקודות האיזואלקטריות שלהם על רצועות הדרגתיות pH מקומיות. החלבונים ברצועה הם לאחר מכן denatured והם ממוקמים על גבי ג'ל polyacrylamide טיפוסי שבו הם מאובטחים במקום עם פתרון ג'ל טרי. לאחר מכן, הפרדת ממד שניה מתבצעת על-ידי SDS-PAGE.

בעוד מיקוד איזואלקטרי אינו האפשרות היחידה עבור אלקטרופורזה ג'ל דו-ממדי, הוא הנפוץ ביותר. אלקטרופורזה ג'ל דו מימדי הוא כלי רב ערך המספק תובנות על מתחמי חלבון וארגון תת-אברונים.

לאחר הפעלת הג'ל, השלב הבא נפוץ מאוד הוא להעביר את החלבונים מן הג'ל על קרום עשוי PVDF או ניילון לניתוח. לאחר מכן אתה יכול להשתמש בנוגדנים ספציפיים כדי לחקור את הממברנה ולחפש חלבונים מעניינים. מוצג כאן הן תוצאות אימונובלוט טיפוסיות שבהן החוקר השתמש ב -3 טכניקות הגברת אותות שונות כדי לקבוע אילו מראה בצורה הטובה ביותר את נוכחותו של חלבון Pit-1 לאורך מספר דילולים סדרתיים.

הרגע צפיתם בסרטון של JoVE על הפרדת חלבונים באמצעות SDS-PAGE. עכשיו אתה צריך להבין את השלבים המעורבים בפתרון חלבון לפי גודל באמצעות טכניקה רבת עוצמה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter