Name: Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education
Uploaded: 2023-04-30T06:22:28.000Z
Description: Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<div id="script_0">
يُعد التحول البكتيري طريقة شائعة الاستخدام يتم من خلالها إدخال DNA غريب إلى البكتيريا، والتي يمكنها بعد ذلك تضخيم هذا الـ DNA أو استنساخه. وتُسمى الخلايا التي لديها القدرة على امتصاص هذا الـ DNA بسهولة بالخلايا المختصة. وبالرغم من أن عملية التحول تحدث بشكل طبيعي في العديد من أنواع البكتيريا، فقد وجد العلماء طرقاً لتحفيز وتعزيز كفاءة الخلية البكتيرية صناعياً. سنتحدث في هذا الفيديو عن إحدى هذه الطرق، وهي التحول بالصدمة الحرارية.
</div>
<div id="script_1">
قبل أن نتحدث عن تقنية الصدمة الحرارية، دعونا نناقش أولاً نوع الحمض النووي الأكثر استخداماً في التحول البكتيري: البلازميد. البلازميد هو حمض نووي DNA صغير، دائري، ومزدوج السلسلة يمكنه تقليل حجمه عن طريق الالتفاف الفائق، بحيث يمكنه المرور بسهولة عبر المسام الموجودة في غشاء الخلية.
يحتوي البلازميد على عدة مناطق مهمة تستحق الذكر. تحتوي البلازميدات المتوفرة تجارياً على موقع استنساخ متعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة تتعرف عليها إنزيمات القطع الداخلية أو إنزيمات القطع، التي تقوم بشطر الحمض النووي DNA. ويمكن إدخال قطع DNA التي تهم الباحث في موقع الاستنساخ المتعدد عندما يتم قطع البلازميد وقطعة DNA باستخدام نفس إنزيمات القطع الداخلية.
تحتوي البلازميدات أيضاً على أصل التضاعف، أو ORI، والذي يوفر معلومات للخلية حول المكان الذي يجب أن يبدأ منه تضاعف البلازميد.
بالإضافة إلى أصل التضاعف وموقع الاستنساخ المتعدد، تتضمن معظم البلازميدات جيناً لمقاومة المضادات الحيوية. يمنح هذا الجين مقاومة للمضادات الحيوية لجميع الخلايا التي تحتوي على البلازميد، مما يسمح لتلك الخلايا بالبقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية.
الآن بعد أن ناقشنا البلازميدات، دعونا نتحدث عن الخلايا التي سيتم إدخالها فيها: الخلايا المختصة. النوع الأكثر استخداماً من البكتيريا في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والتحول هو E. coli، والتي تتواجد أيضاً في أمعائك الغليظة. عادةً ما يتم جعل الخلايا مختصة عن طريق تعريضها لبيئة غنية بالكالسيوم.
تعمل الشحنات الموجبة لأيونات الكالسيوم على تحييد الشحنات السالبة لكل من البلازميد وجدار الخلية البكتيرية، مما يؤدي إلى تبديد التنافر الإلكتروستاتيكي وإضعاف جدار الخلية.
من خلال تعريض الخلايا لزيادة مفاجئة في درجة الحرارة، أو الصدمة الحرارية، ينشأ فرق في الضغط بين الجزء الخارجي والداخلي للخلية، مما يحفز تكوين مسام يمكن من خلالها دخول الحمض النووي DNA للبلازميد الملتف فائقاً. وبعد إعادة الخلايا إلى درجة حرارة طبيعية، يقوم جدار الخلية بمعالجة نفسه تلقائياً.
بمجرد أن تمتص الخلايا البلازميد، ستصبح قادرة على النمو في أطباق الآجار الممزوجة بالمضادات الحيوية.
</div>
<div id="script_2">
قبل البدء في عملية التحول بالصدمة الحرارية، قم بتنظيف منطقة العمل وتأكد من تعقيم جميع المعدات.
تأكد من تحضير كمية كافية من الأوساط الغذائية والآجار، والتي توفر التغذية للبكتيريا التي ستجعلها مختصة. كما يجب التأكد من تعقيم جميع المحاليل بواسطة الموصدة (autoclaving). اترك الأوساط السائلة تبرد حتى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، واترك الآجار يبرد حتى 50-55˚C، وهي درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وصب الأطباق. اترك الأطباق تبرد حتى درجة حرارة الغرفة لتتصلب.
عند العمل مع البكتيريا، يجب دائمًا استخدام تقنية التعقيم (aseptic technique) للحفاظ على العقامة. تتضمن تقنية التعقيم عادةً استخدام موقد بنزن لتعقيم الأدوات والكواشف وخلق تيار حمل حراري – مما يمنع الملوثات المحمولة في الهواء من الدخول إلى منطقة العمل.
قبل تفاعل الصدمة الحرارية مباشرةً، قم بتدفئة الأوساط الغذائية مسبقًا لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، وأطباق آجار LB المحتوية على المضاد الحيوي إلى 37°C. تأكد أيضًا من أن الحمام المائي عند 42°C.
بعد ذلك، قم بإذابة الخلايا المختصة كيميائيًا على الثلج.
أضف 1-5uL من البلازميد البارد بتركيز 1ng/μL إلى الخلايا البكتيرية، واخلط بلطف، ثم أعد خليط الخلايا والبلازميد إلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
عند انتهاء الوقت، قم بإجراء الصدمة الحرارية لخليط الخلايا والبلازميد عن طريق وضعه في حمام مائي عند 42˚C لمدة 30 ثانية.
مباشرة بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي، ضعه على الثلج وأضف 450μL من الوسط الغذائي. ضعه في حاضنة هزازة عند 37°C لمدة ساعة واحدة بسرعة تزيد عن 225 rpm لتمكين الخلايا من التعافي.
باستخدام تقنية التعقيم المناسبة، أضف 20-200uL من البكتيريا إلى طبق آجار LB ووزع الوسط حول الطبق باستخدام ناشر بكتيري. قم بتحضين الأطباق طوال الليل عند 37˚C بشكل مقلوب لمنع تعرض البكتيريا للتكثيف.
في اليوم التالي، تشكل البكتيريا التي استقبلت البلازميد مستعمرات.
بعد ذلك، قم بعدّ المستعمرات لحساب كفاءة التحول، وهي عدد المحولات الناجحة مقسومة على الكمية الإجمالية من DNA التي تم وضعها في الأطباق.
الآن، يمكن اختيار المستعمرات لإجراء مزيد من التجارب.
</div>
<div id="script_3">
تُخزن البكتيريا المستخدمة في عملية التحول في المجمد قبل جعلها كفؤة. ويجب إذابتها على الثلج، وفردها على طبق آغار - خالي من المضادات الحيوية، وتركها لتنمو طوال الليل عند 37˚C.
باستخدام تقنية التعقيم، اختر مستعمرة بكتيرية من طبق الآغار وقم بتنميتها في مزرعة كبيرة سعة 500 ml طوال الليل عند 37˚C في حاضنة هزازة - وهي جهاز يمنع ترسب البكتيريا ويضمن توزيع العناصر الغذائية بشكل متساوٍ في الوسط الزرعي.
أثناء نمو الخلايا، قم بتحضير محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar ومحلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol، ثم قم بتعقيمهما باستخدام الأوتوكلاف واتركهما ليبردا.
تُستخدم قياسات الامتصاصية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط (mid-log phase) من عدمه، وهي المرحلة التي تكون فيها الخلايا مستعدة لامتصاص DNA بسهولة. وبمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة، ضعها على الثلج وأبقِها هناك طوال فترة الإجراء.
بعد ذلك، افصل الخلايا البكتيرية إلى أنبوبي طرد مركزي كبيرين وقم بدورانهما عند 4°C. اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في حوالي 100 ml من كلوريد الكالسيوم البارد بتركيز 0.1 molar. ثم حضن الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة. وتكرر هذه الخطوة مرة واحدة أخرى على الأقل. وغالباً ما يشار إلى دورات الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا باسم غسل الخلايا.
بعد الغسلة النهائية، أعد تعليق الخلايا في 50mL باردة من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 molar مضافاً إليه 15% glycerol. وتصبح هذه الخلايا الآن كفؤة كيميائياً.
وزع 50μL من البكتيريا في عدة أنابيب طرد مركزي دقيقة (microfuge tubes) واحفظها عند -80˚C حتى يحين موعد الصدمة الحرارية.
</div>
<div id="script_4">
توجد العديد من التطبيقات والمتغيرات لعملية التحول البكتيري.
بالإضافة إلى الصدمة الحرارية، يعد التثقيب الكهربائي تقنية شائعة أخرى للتحول. وكما يوحي اسمه، يتضمن التثقيب الكهربائي استخدام الكهرباء لإحداث ثقوب في غشاء الخلية البكتيرية يمكن من خلالها مرور DNA.
وفيما يتعلق بفحص البكتيريا المتحولة، غالبًا ما تحتوي البلازميدات على جين يشفر لإنزيم beta-galactosidase للمساعدة في عملية الفحص. وعندما يتم تضمين المادة الركيزة لهذا الإنزيم في أطباق الآجار، فإن البكتيريا التي تحولت بواسطة بلازميدات تحتوي على قطعة مدرجة تعطي مستعمرات بيضاء، بينما تعطي البكتيريا التي لا تحتوي عليها مستعمرات زرقاء. وتُعرف هذه الطريقة باسم الفحص الأزرق والأبيض.
في معظم تجارب التحول، يكون الهدف هو الحصول على بكتيريا سريعة الانقسام لإنتاج كميات كبيرة من البلازميد الخاص بك، والذي يتضمن الجين المستهدف. بعد التحول البكتيري، تتمثل الخطوة التالية في تنمية كميات كبيرة من البكتيريا في وسط سائل يحتوي على مضادات حيوية وإجراء تنقية البلازميد، والتي تتضمن، كما يشير اسمها، تنقية البلازميدات من البكتيريا. وتتوفر العديد من المجموعات التجارية المجهزة لهذا الغرض.
أحيانًا يكون الهدف من التحول هو جعل البكتيريا تنتج كميات كبيرة من البروتين الذي يشفره البلازميد. ترى هنا الخلايا البكتيرية يتم تجانسها وتحليلها قبل إجراء تقنية تسمى التنقية بالألفة لعزل البروتين المستهدف. وبعد تنقية كميات كبيرة من البروتين، يمكن بلورته ومن ثم تحديد بنية البروتين المعني.
</div>
<div id="script_5">
لقد شاهدتم للتو مقدمة JoVE حول تحويلات الصدمة الحرارية. لقد استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية تحويل الصدمة الحرارية وآلية عمله، والمبدأ الذي يقوم عليه، وكيفية تحويل البكتيريا بنجاح. شكراً للمشاهدة!
</div>

التحول البكتيري: طريقة الصدمة الحرارية

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

التحول هو العملية التي تحدث عندما تمتص الخلية DNA غريباً من محيطها. ويمكن أن يحدث التحول في الطبيعة في أنواع معينة من البكتيريا. وفي البيولوجيا الجزيئية، يتم إعادة إنتاج التحول صناعياً في المختبر عن طريق إنشاء مسام في أغشية الخلايا البكتيرية. وتسمى الخلايا البكتيرية القادرة على امتصاص DNA من البيئة بالخلايا المختصة. وفي المختبر، يمكن جعل الخلايا البكتيرية مختصة ومن ثم إدخال DNA إليها من خلال إجراء يسمى طريقة الصدمة الحرارية.
تستخدم عملية التحول بالصدمة الحرارية بيئة غنية بالكالسيوم يوفرها كلوريد الكالسيوم لمعادلة التنافر الكهروستاتيكي بين الحمض النووي البلازميدي والغشاء الخلوي البكتيري. ويؤدي الارتفاع المفاجئ في درجة الحرارة إلى تكوين ثقوب في الغشاء البلازمي للبكتيريا، مما يسمح للحمض النووي البلازميدي بالدخول إلى الخلية البكتيرية. يستعرض هذا الفيديو إجراءً تفصيلياً خطوة بخطوة حول كيفية تحضير بكتيريا ذات كفاءة كيميائية، وإجراء التحول بالصدمة الحرارية، وزراعة البكتيريا المتحولة في أطباق، وحساب كفاءة التحول.

تعد عملية التحول (Transformation) هي العملية التي تحدث عندما تمتص الخلية حمضاً نووياً غريباً (foreign DNA) من محيطها. ويمكن أن يحدث التحول في الطبيعة في أنواع معينة من...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Education

JoVE Science Education

جوف للتعليم العلمي (JoVE Science Education)

Basic Biology

أساسيات علم الأحياء

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

الطرق الأساسية في علم الأحياء الخلوي والجزيئي

basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology

using a hemacytometer to count cells

استخدام مقياس الدم لعد الخلايا

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant ...

passaging cells

خلايا المرور

Cell lines are frequently used in biomedical experiments, as they allow rapid culture and expansion of cell types for experimental analysis. Cell lines ...

pcr: the polymerase chain reaction

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): تفاعل البوليميراز المتسلسل

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

dna gel electrophoresis

الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

separating protein with sds-page

فصل البروتين باستخدام SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

bacterial transformation: the heat shock method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

bacterial transformation: electroporation

التحول البكتيري: التثقيب الكهربائي

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

the elisa method

طريقة ELISA

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is typically performed to detect the presence and/or amount of a target protein of interest within an ...

plasmid purification

تنقية البلازميد

Plasmid purification is a technique used to isolate and purify plasmid DNA from genomic DNA, proteins, ribosomes, and the bacterial cell wall. A plasmid ...

gel purification

تنقية الجل

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

the western blot

اللطخة الغربية

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

an introduction to transfection

مقدمة في التعدي

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

dna ligation reactions

تفاعلات ربط الحمض النووي

In molecular biology, ligation refers to the joining of two DNA fragments through the formation of a phosphodiester bond.  An enzyme known as a ligase ...

restriction enzyme digests

هضم إنزيم التقييد

Restriction enzymes or endonucleases recognize and cut DNA at a specific sequence.  These enzymes occur naturally in bacteria as a defense against ...

molecular cloning

الاستنساخ الجزيئي

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

This collection demonstrates how to execute basic techniques commonly used in cellular and molecular biology.

خض هذا الاختبار لتقييم فهمك لعملية التحول البكتيري وطريقة الصدمة الحرارية. تغطي الأسئلة التدريبية بكتيريا E. coli المختصة، والبلازميدات، وموقع الاستنساخ المتعدد، وأصل التضاعف، وجينات مقاومة المضادات الحيوية، وكلوريد الكالسيوم، والصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية، واختيار المستعمرات.

ما هو الغرض الرئيسي من التحول البكتيري؟

تُسمى الخلايا التي تمتص الحمض النووي (DNA) بسهولة بالخلايا المختصة.

البلازميد هو {{slot:blank_1}} صغير، دائري، ومزدوج السلاسل.

ما هو دور موقع الاستنساخ المتعدد في البلازميد؟

يحدد أصل التضاعف للخلية المكان الذي يجب أن يبدأ منه تضاعف البلازميد.

ما هي سمة البلازميد التي تسمح للخلايا المحولة بالبقاء على قيد الحياة في الأوساط التي تحتوي على مضادات حيوية؟ {{slot:dropdown_1}}

لماذا يتم تعريض الخلايا لبيئة غنية بالكالسيوم قبل عملية التحول؟

أثناء الصدمة الحرارية، تتكون مسام تسمح للحمض النووي البلازميدي فائق الالتفاف بالدخول إلى الخلية.

ما هو الغرض الرئيسي من تقنية التعقيم في العمل البكتيري؟

ما هو تسلسل الخطوات الذي يطابق بشكل أفضل إجراء الصدمة الحرارية بعد إذابة الخلايا المختصة؟

تدريب: التحول البكتيري: طريقة الصدمة الحرارية Quiz

يغطي اختبار التقييم هذا المفاهيم الأساسية في عملية التحول البكتيري بالصدمة الحرارية، بما في ذلك دخول البلازميد فائق الالتفاف عبر مسام الغشاء، وكميات البلازميد النموذجية المستخدمة، ودور التحول في تضخيم الحمض النووي الغريب، وتوقيت إضافة المضادات الحيوية إلى أطباق الآجار الانتقائية، وتفسير نتائج فحص اللون الأزرق والأبيض للتحقق من امتصاص البلازميد مأشوب الجينات.

Video Quiz

يغطي اختبار التقييم هذا الطرق الأساسية في البيولوجيا الجزيئية والخلوية، بما في ذلك عد الخلايا وحيويتها باستخدام مقياس كرات الدم (hemacytometer)، وتمرير الخلايا وظروف الزرع، وتصميم وتدوير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والترحيل الكهربائي لهلام الحمض النووي (DNA) وتنقيته، والترحيل الكهربائي للهلام بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE) واللطخة المناعية، والتحول البكتيري عن طريق الصدمة الحرارية والتثقيب الكهربائي، والكشف عن البروتين القائم على مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وتنقية البلازميد.

Chapter Quiz

أساسيات البيولوجيا - الفصل ٢: الطرق الأساسية في البيولوجيا الخلوية والجزيئية

Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education