Name: Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education
Uploaded: 2023-04-30T06:22:28.000Z
Description: Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<div></div><div id="script_0">
Transformación bacteriana es un método ampliamente utilizado donde se introduce ADN extraño en una bacteria, que entonces puede amplificar o clonar el ADN. Las células que tienen la capacidad para fácilmente tomar este ADN se denominan células competentes. Aunque la transformación se produce naturalmente en muchos tipos de bacterias, los científicos han encontrado maneras de inducir artificialmente y mejorar la capacidad de una célula bacteriana. En este video vamos a hablar sobre una de estas maneras, transformación de choque de calor.
</div>
<div id="script_1">
Antes de hablar de la técnica de choque de calor, vamos a discutir primero el tipo de ADN más comúnmente-utilizado en la transformación bacteriana: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena de ADN que puede reducir su tamaño por superenrollamiento, por lo que puede pasar fácilmente a través de poros en la membrana de la célula.
Un plásmido contiene algunas regiones importantes digno de mencionar. Plásmidos disponibles comercialmente contienen un sitio de clonación múltiple o MCS. Esta región contiene secuencias específicas reconocidas por endonucleasas de restricción o enzimas de restricción, que hender la DNA. Fragmentos de ADN de interés para el investigador pueden introducirse en el sitio de clonación múltiple del plásmido y el fragmento de ADN se cortan con las endonucleasas mismo.
Plásmidos también contienen un origen de replicación, o ORI, que proporciona información a la celda donde debe comenzar la replicación del plásmido.
Además el origen de replicación y el sitio de clonación múltiple, la mayoría de plásmidos incluirá un gen de resistencia a los antibióticos. Este gen confiere resistencia a los antibióticos a todas las celdas que contienen el plásmido, permitiendo que esas células a sobrevivir en el antibiótico que contiene los medios de comunicación.
Ahora que hemos analizado plásmidos, vamos a hablar de las células en que se presentará: las células competentes. La más comúnmente utilizada tipo de bacterias en la investigación de la biología molecular y transformación es e. coli, que también habitan el intestino inferior. Las células típicamente se hacen competentes a través de la exposición a un ambiente rico de calcio.
Las cargas positivas de los iones de calcio neutralizan las cargas negativas de los plásmidos y la pared celular bacteriana disipando la repulsión electrostática y debilitamiento de la pared celular.
Al exponer las células a un aumento repentino en la temperatura o choque térmico, se crea una diferencia de presión entre el exterior y el interior de la célula, que induce la formación de poros, a través del cual se puede introducir DNA plasmídico superenrollado. Después de regresar a las células a una temperatura normal, la pared celular le self-heal.
Una vez que las células han tomado en el plásmido, serán capaces de crecer en placas de agar con antibióticos.
</div>
<div id="script_2">
Antes de comenzar la transformación de choque de calor, limpiar área de trabajo y asegúrese de que todos los equipos son esterilizados.
Asegúrese de que tiene suficientes medios y preparado, de agar que proporcionan la nutrición a las bacterias que competente. También asegúrese de esterilizar todas las soluciones mediante autoclave. Permite medio líquido a enfriar a temperatura ambiente antes de su uso y deje enfriar el agar a 50-55˚C, la temperatura a la que pueden añadirse antibióticos y vertieron de placas. Permita que las placas se enfríe a temperatura ambiente para solidificar.
Cuando se trabaja con bacterias, uno siempre debe utilizar técnica aséptica para mantener la esterilidad. Técnica aséptica implica típicamente el uso de un mechero de Bunsen para esterilizar instrumentos y reactivos y crear una convección actual – que mantiene contaminantes en el aire en el espacio de trabajo.
Inmediatamente antes de la reacción de choque de calor, caliente previamente sus medios a la temperatura ambiente y que contiene el antibiótico LB las placas de agar a 37 ° C. También asegúrese de que su baño esté a 42° C.
A continuación, descongelar células químicamente competentes en el hielo.
Agregar, 1-5uL de 1ng/μL frío plásmido a las células bacterianas, mezclar suavemente y devolver la mezcla celular y plásmido de hielo durante 30 minutos.
Cuando el tiempo está para arriba, calor descarga la mezcla de células y plásmido colocando en un baño de agua a 42˚C durante 30 segundos.
Inmediatamente después de tomar el tubo de la bañera de agua ponlo en hielo y añadir 450μL de medios de comunicación. Colóquelo en una agitación incubadora de 37° C durante 1 hora a más de 225 rpm para que las células pueden recuperar.
Utilizando una técnica aséptica adecuada, añadir bacterias 20-200uL a una placa de agar LB y difundir el medio alrededor con un esparcidor bacteriano. Incubar las placas durante la noche en 37˚C boca abajo para prevenir la exposición de las bacterias a condensación.
Al día siguiente, las bacterias que han tenido en el plásmido forman colonias.
A continuación, cuente las colonias para calcular la eficiencia de transformación, que es el número de transformantes éxito dividido por la cantidad total de ADN plateado.
Ahora, las colonias pueden seleccionarse para más experimentación.
</div>
<div id="script_3">
Antes de hacerse competentes las bacterias utilizadas en la transformación se almacenan en el congelador. Debe ser descongelados en el hielo, extender sobre una placa de agar, sin antibióticos y permitió crecer durante la noche en 37˚C.
Utilizando una técnica aséptica, seleccionar una colonia de bacterias de la placa de agar y crecer en una cultura grande 500 ml durante la noche en 37˚C en un incubador de agitación – un instrumento, que evita la sedimentación de las bacterias y la dispersión uniforme de nutrientes en los medios de comunicación.
Mientras que las células están creciendo hacer 0.1 molar cloruro de calcio y 0,1 molar cloruro de calcio además de soluciones de glicerol al 15%, autoclave y deje enfriar.
Las mediciones de absorbancia se utilizan para determinar si es o no la bacteria en su fase de registro medio de crecimiento, lo cual significa que fácilmente se ocupan de ADN. Una vez que las células han alcanzado esta fase, coloque en hielo y mantenerlos allí durante todo el procedimiento.
A continuación, separar las células bacterianas en dos tubos de centrífuga grande y centrifugar a 4° C. Retirar el sobrenadante y resuspender en 100 ml 0.1 molar frío de cloruro de calcio. Luego, incubar las células en hielo durante 30 minutos. Este paso se repite al menos una vez más. Ciclos de spinning y resuspender las células se refieren a menudo como lavar las células.
Después del último lavado, resuspender las células en un frío 50mL 0.1 molar cloruro de calcio además de solución de glicerol 15%. Estas células son ahora químicamente competentes.
Distribuir 50μL de bacterias en varios tubos de microcentrífuga y conservarlo a - 80˚C hasta que esté listo para el choque del calor.
</div>
<div id="script_4">
Existen muchas aplicaciones y variaciones de transformación bacteriana.
Además de golpes de calor, eletroporation es otra técnica común para la transformación. Como su nombre lo indica electroporación implica el uso de electricidad para hacer poros en la membrana celular bacteriana a través del cual el ADN puede pasar.
Con respecto a la detección de bacterias transformadas, plásmidos a menudo contienen un gen que codifica la enzima beta-galactosidasa para ayudar con la investigación. Cuando el sustrato para esta enzima está incluido en las placas de agar, las bacterias que han sido transformadas con plásmidos que contienen un relleno producen colonias blancas, mientras que los que no lo hacen, la producción de colonias azules. Este método se conoce como proyección azul y blanco.
En experimentos de transformación de la mayoría el objetivo es obtener rápidamente dividiendo las bacterias para hacer grandes cantidades de su plásmido, que incluye el gene de la blanco. Después de la transformación bacteriana, el siguiente paso es crecer grandes cantidades de bacterias en medio líquido que contiene antibiótico y purificación del plásmido, que, como su nombre lo indica, consiste en la purificación de la plásmidos de las bacterias. Muchos kits comerciales están disponibles para este propósito.
A veces el objetivo de transformación es que las bacterias generan grandes cantidades de la proteína codificada por el plásmido. Aquí puede ver las células bacterianas se homogeneizó y lisis antes de una técnica llamada purificación de afinidad puede realizarse para aislar la proteína diana. Después de purificar grandes cantidades de la proteína puede ser cristalizado luego y estructura de la proteína particular de interés puede ser identificado.
</div>
<div id="script_5">
Sólo ha visto JoVE Introducción a las transformaciones de choque de calor. En este video repasamos: Qué transformación de choque de calor es y cómo funciona, el director detrás de él y cómo éxito transformar bacterias. ¡Gracias por ver!
</div>

transformación bacteriana: el método por choque térmico

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformación es el proceso que ocurre cuando una célula ingiere ADN extraño de sus alrededores. Transformación puede ocurrir en la naturaleza en ciertos tipos de bacterias. En biología molecular, transformación es reproducir artificialmente en el laboratorio mediante la creación de poros en las membranas celulares bacterianas. Las células bacterianas que son capaces de tomar ADN del ambiente se denominan células competentes. En el laboratorio, las células bacterianas pueden hacerse competentes y ADN introducida posteriormente por un procedimiento llamado el método de choque de calor.
Transformación de choque de calor utiliza un ambiente rico de calcio proporcionado por cloruro de calcio para contrarrestar la repulsión electrostática entre el ADN plásmido y la membrana celular bacteriana. Un aumento repentino en la temperatura crea poros en la membrana plasmática de las bacterias y ADN plásmido permite entrar en la célula bacteriana. Este video va a través de un procedimiento paso a paso sobre cómo crear bacteria químicamente competente, realizar transformación de choque de calor, placa de la bacteria transformada y calcular la eficiencia de transformación.

Transformación bacteriana: El método por choque térmico

La transformación es el proceso que ocurre cuando una célula ingiere ADN extraño de su entorno. La transformación puede ocurrir en la naturaleza en ciertos tipos de ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Education

Educación

JoVE Science Education

JoVE Educación Científica

Basic Biology

Biología básica

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Métodos básicos de biología celular y molecular

basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology

using a hemacytometer to count cells

Usando el hemacitómetro para el conteo celular

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant ...

passaging cells

Pases celular

Cell lines are frequently used in biomedical experiments, as they allow rapid culture and expansion of cell types for experimental analysis. Cell lines ...

pcr: the polymerase chain reaction

PCR: La reacción en cadena de polimerasa

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

dna gel electrophoresis

Electroforesis en gel de DNA

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

separating protein with sds-page

Separación de proteínas en SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

bacterial transformation: the heat shock method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

bacterial transformation: electroporation

Transformación bacteriana: Electroporación

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

the elisa method

El método de ELISA

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is typically performed to detect the presence and/or amount of a target protein of interest within an ...

plasmid purification

Purificación de plásmidos

Plasmid purification is a technique used to isolate and purify plasmid DNA from genomic DNA, proteins, ribosomes, and the bacterial cell wall. A plasmid ...

gel purification

Purificación del gel

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

the western blot

Western Blot

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

an introduction to transfection

Introducción a la transfección

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

dna ligation reactions

Reacciones de ligación de ADN

In molecular biology, ligation refers to the joining of two DNA fragments through the formation of a phosphodiester bond.  An enzyme known as a ligase ...

restriction enzyme digests

Digestiones enzimáticas restricción

Restriction enzymes or endonucleases recognize and cut DNA at a specific sequence.  These enzymes occur naturally in bacteria as a defense against ...

molecular cloning

Clonación molecular

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

métodos básicos de biología celular y molecular

Esta colección demuestra cómo reallizar técnicas básicas comunes de biología celular y molecular.

Realice este cuestionario para poner a prueba su comprensión de la transformación bacteriana y el método de choque térmico. Las preguntas de práctica abarcan E. coli competente, plásmidos, el sitio de clonación múltiple, el origen de replicación, los genes de resistencia a los antibióticos, el cloruro de calcio, el choque térmico a 42 °C y la selección de colonias.

¿Cuál es el propósito principal de la transformación bacteriana?

Las células que captan el ADN con facilidad se denominan células competentes.

Un plásmido es una {{slot:blank_1}} pequeña, circular y de cadena doble.

¿Cuál es la función del sitio de clonación múltiple en un plásmido?

El origen de replicación indica a la célula dónde debe comenzar la replicación del plásmido.

¿Qué característica del plásmido permite que las células transformadas sobrevivan en medios que contienen antibióticos? {{slot:dropdown_1}}

¿Por qué se exponen las células a un entorno rico en calcio antes de la transformación?

Durante el choque térmico, se forman poros que permiten que el ADN plasmídico superenrollado entre en la célula.

¿Cuál es el propósito principal de la técnica aséptica en el trabajo bacteriológico?

¿Cuál secuencia de pasos coincide mejor con el procedimiento de choque térmico después de descongelar las células competentes?

Transformación bacteriana: El método por choque térmico Quiz

Este cuestionario de evaluación abarca conceptos clave de la transformación bacteriana por choque térmico, incluyendo la entrada de plásmidos superenrollados a través de los poros de la membrana, las cantidades típicas de plásmidos utilizadas, el papel de la transformación en la amplificación de ADN foráneo, el momento en que se añaden los antibióticos a los placas de agar selectivas y la interpretación de los resultados del cribado azul-blanco para la captación de plásmidos recombinantes.

Video Quiz

Este cuestionario de evaluación abarca métodos fundamentales de biología celular y molecular, incluidos el recuento y la viabilidad celular mediante hemocitómetro, el pasaje celular y las condiciones de cultivo, el diseño y el ciclado de la PCR, la electroforesis y purificación de geles de ADN, SDS-PAGE e inmunotransferencia, la transformación bacteriana por choque térmico y electroporación, la detección de proteínas basada en ELISA y la purificación de plásmidos.

Chapter Quiz

Biología básica - Cap. 2: Métodos básicos en biología celular y molecular

Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education