Name: Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education
Uploaded: 2023-04-30T06:22:28.000Z
Description: Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<div id="script_0">
Transformacja bakteryjna jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania obcego DNA do bakterii, która może następnie amplifikować lub klonować ten materiał genetyczny. Komórki posiadające zdolność do łatwego pobierania DNA nazywane są komórkami kompetentnymi. Choć transformacja występuje naturalnie u wielu rodzajów bakterii, naukowcy opracowali metody sztucznego indukowania i zwiększania kompetencji komórek bakteryjnych. W tym filmie omówimy jedną z tych metod – transformację za pomocą szoku termicznego.
</div>
<div id="script_1">
Zanim omówimy technikę szoku termicznego, przyjrzyjmy się najczęściej stosowanemu w transformacji bakteryjnej rodzajowi DNA: plazmidowi. Plazmid to mała, kolista, dwuniciowa cząsteczka DNA, która może zmniejszyć swój rozmiar poprzez superzwinięcie, dzięki czemu może łatwo przenikać przez pory w błonie komórkowej.
Plazmid zawiera kilka istotnych regionów, o których warto wspomnieć. Plazmidy dostępne komercyjnie zawierają miejsce wielokrotnego klonowania, czyli MCS. Region ten zawiera specyficzne sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne, które przecinają DNA. Fragmenty DNA interesujące badacza mogą zostać wstawione do miejsca wielokrotnego klonowania, gdy plazmid i fragment DNA zostaną przecięte tymi samymi endonukleazami.
Plazmidy zawierają również miejsce inicjacji replikacji, czyli ORI, które dostarcza komórce informacji o tym, gdzie powinna rozpocząć się replikacja plazmidu.
Oprócz miejsca inicjacji replikacji i miejsca wielokrotnego klonowania, większość plazmidów zawiera gen oporności na antybiotyki. Gen ten nadaje oporność na antybiotyki wszystkim komórkom zawierającym plazmid, umożliwiając im przetrwanie w pożywkach zawierających antybiotyk.
Po omówieniu plazmidów porozmawiajmy o komórkach, do których zostaną one wprowadzone: komórkach kompetentnych. Najczęściej stosowanym w badaniach biologii molekularnej i transformacji rodzajem bakterii jest E. coli, która występuje również w dolnym odcinku jelit człowieka. Komórki stają się zazwyczaj kompetentne poprzez poddanie ich działaniu środowiska bogatego w wapń.
Dodatnie ładunki jonów wapnia neutralizują ujemne ładunki zarówno plazmidu, jak i bakteryjnej ściany komórkowej, co niweluje odpychanie elektrostatyczne i osłabia ścianę komórkową.
Poprzez poddanie komórek gwałtownemu wzrostowi temperatury, czyli szokowi termicznemu, powstaje różnica ciśnień między wnętrzem a zewnętrzem komórki, co indukuje tworzenie się porów, przez które może wniknąć superzwinięte DNA plazmidowe. Po przywróceniu komórek do normalnej temperatury, ściana komórkowa ulega samoregeneracji.
Gdy komórki pobiorą plazmid, będą one w stanie rosnąć na płytkach z agarem z dodatkiem antybiotyku.
</div>
<div id="script_2">
Przed rozpoczęciem transformacji metodą szoku termicznego należy oczyścić obszar roboczy i upewnić się, że cały sprzęt został wysterylizowany.
Należy upewnić się, że przygotowano wystarczającą ilość pożywek i agaru, które zapewnią odżywienie bakterii poddawanych procesowi czynienia kompetentnymi. Należy również wysterylizować wszystkie roztwory w autoklawie. Przed użyciem należy pozwolić pożywkom w płynie ostygnąć do temperatury pokojowej, a agarowi schłodzić do 50-55˚C – jest to temperatura, w której można dodać antybiotyk i zalać szalki. Następnie należy pozostawić szalki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej w celu zastygnięcia agaru.
Podczas pracy z bakteriami należy zawsze stosować techniki aseptyczne w celu zachowania sterylności. Technika aseptyczna zazwyczaj obejmuje użycie palnika Bunsena do sterylizacji narzędzi i odczynników oraz wytworzenie prądu konwekcyjnego, który zapobiega przedostawaniu się zanieczyszczeń z powietrza do obszaru roboczego.
Bezpośrednio przed reakcją szoku termicznego należy ogrzać pożywki do temperatury pokojowej, a szalki z agarem LB zawierającym antybiotyk do 37°C. Należy również upewnić się, że łaźnia wodna jest nagrzana do 42°C.
Następnie należy rozmrozić chemicznie kompetentne komórki na lodzie.
Do komórek bakteryjnych należy dodać 1-5uL zimnego plazmidu o stężeniu 1ng/μL, delikatnie wymieszać, a następnie przenieść mieszaninę komórek i plazmidu z powrotem na lód na 30 minut.
Po upływie tego czasu należy poddać mieszaninę komórek i plazmidu szokowi termicznemu, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 42˚C na 30 sekund.
Natychmiast po wyjęciu probówki z łaźni wodnej należy umieścić ją na lodzie i dodać 450μL pożywki. Następnie probówkę należy umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C na 1 godzinę przy prędkości powyżej 225 rpm, aby komórki mogły przejść regenerację.
Stosując właściwą technikę aseptyczną, należy nanieść 20-200uL bakterii na szalkę z agarem LB i rozprowadzić pożywkę za pomocą rozsypacza do bakterii. Szalki należy inkubować przez noc w temperaturze 37˚C w pozycji odwróconej, aby zapobiec kontaktowi bakterii z kondensatem.
Następnego dnia bakterie, które pobrały plazmid, tworzą kolonie.
Następnie należy policzyć kolonie, aby obliczyć wydajność transformacji, która jest stosunkiem liczby udanych transformantów do całkowitej ilości DNA naniesionego na szalkę.
Teraz można wyselekcjonować kolonie do dalszych eksperymentów.
</div>
<div id="script_3">
Przed uczynieniem ich kompetentnymi, bakterie wykorzystywane w transformacji są przechowywane w zamrażarce. Należy je rozmrozić na lodzie, wysiać na płytkę z agarem – bez antybiotyków – i inkubować przez noc w temperaturze 37˚C.
Stosując technikę aseptyczną, należy wybrać kolonię bakterii z płytki z agarem i namnożyć ją w dużej kulturze 500 ml przez noc w temperaturze 37˚C w inkubatorze z wytrząsaniem – urządzeniu, które zapobiega sedymentacji bakterii i zapewnia równomierne rozprowadzenie składników odżywczych w pożywce.
Podczas wzrostu komórek należy przygotować roztwory 0.1 M chlorku wapnia oraz 0.1 M chlorku wapnia z dodatkiem 15% glicerolu, wysterylizować je w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia.
Pomiary absorbancji służą do określenia, czy bakterie znajdują się w średniej fazie logarytmicznej wzrostu, w której łatwo pobierają DNA. Po osiągnięciu tej fazy przez komórki, należy umieścić je na lodzie i utrzymywać w tej temperaturze przez cały czas trwania procedury.
Następnie komórki bakteryjne należy rozdzielić do dwóch dużych probówek do wirowania i wirować w temperaturze 4°C. Należy odlać nadsącz i zawiesić komórki w około 100 ml zimnego 0.1 M chlorku wapnia. Następnie komórki inkubuje się na lodzie przez 30 minut. Krok ten powtarza się co najmniej raz. Cykle wirowania i ponownego zawieszenia komórek są często określane jako przemywanie komórek.
Po ostatnim przemyciu komórki zawiesza się w zimnym 50 mL 0.1 M roztworze chlorku wapnia z 15% glicerolem. Komórki te są teraz chemicznie kompetentne.
Należy rozdzielić po 50μL bakterii do wielu probówek do mikrowirowania i przechowywać w temperaturze -80˚C do momentu przeprowadzenia szoku termicznego.
</div>
<div id="script_4">
Istnieje wiele zastosowań i wariantów transformacji bakteryjnej.
Oprócz szoku termicznego, inną powszechnie stosowaną techniką transformacji jest elektroporacja. Jak wynika z nazwy, elektroporacja polega na wykorzystaniu prądu elektrycznego do tworzenia w błonie komórkowej bakterii porów, przez które może przeniknąć DNA.
W odniesieniu do selekcji transformowanych bakterii, plazmidy często zawierają gen kodujący enzym beta-galaktozydazę, aby ułatwić ten proces. Gdy podłoże dla tego enzymu znajduje się w płytkach z agarem, bakterie transformowane plazmidami zawierającymi insert tworzą białe kolonie, natomiast te, które go nie posiadają, tworzą kolonie niebieskie. Metoda ta nazywana jest selekcją niebiesko-białą.
W większości eksperymentów z transformacją celem jest uzyskanie szybko dzielących się bakterii, aby wyprodukować duże ilości plazmidu zawierającego gen docelowy. Po transformacji bakteryjnej kolejnym krokiem jest namnożenie dużej ilości bakterii w płynnym medium zawierającym antybiotyk i przeprowadzenie oczyszczania plazmidów, co, zgodnie z nazwą, polega na wyizolowaniu plazmidów z bakterii. W tym celu dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów.
Czasami celem transformacji jest zmuszenie bakterii do wytworzenia dużych ilości białka kodowanego przez plazmid. Tutaj widzimy homogenizację i lizę komórek bakteryjnych przed przeprowadzeniem techniki zwanej oczyszczaniem powinowactwa w celu izolacji białka docelowego. Po oczyszczeniu dużych ilości białka można je skrystalizować, co pozwala na zidentyfikowanie struktury konkretnego białka będącego przedmiotem badań.
</div>
<div id="script_5">
Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE Wprowadzenie do transformacji metodą szoku termicznego. W tym materiale omówiliśmy: czym jest transformacja metodą szoku termicznego i jak ona przebiega, zasadę jej działania oraz sposób skutecznej transformacji bakterii. Dziękujemy za uwagę!
</div>

transformacja bakteryjna: metoda szoku termicznego

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformacja to proces, który zachodzi, gdy komórka pobiera obcy DNA z otoczenia. Transformacja może występować w naturze u niektórych rodzajów bakterii. W biologii molekularnej transformację odtwarza się sztucznie w laboratorium poprzez tworzenie porów w błonach komórkowych bakterii. Komórki bakteryjne zdolne do pobierania DNA ze środowiska nazywa się komórkami kompetentnymi. W warunkach laboratoryjnych komórki bakteryjne można uczynić kompetentnymi, a następnie wprowadzić do nich DNA za pomocą procedury zwanej metodą szoku termicznego.
Transformacja metodą szoku termicznego wykorzystuje środowisko bogate w wapń, zapewnione przez chlorek wapnia, aby zniwelować odpychanie elektrostatyczne między plazmidowym DNA a błoną komórkową bakterii. Nagły wzrost temperatury powoduje powstanie porów w błonie plazmatycznej bakterii i umożliwia wniknięcie plazmidowego DNA do wnętrza komórki bakteryjnej. W tym filmie przedstawiono szczegółową procedurę krok po kroku, dotyczącą przygotowania chemicznie kompetentnych bakterii, przeprowadzenia transformacji metodą szoku termicznego, wysiania przekształconych bakterii na szalki oraz obliczenia wydajności transformacji.

Transformacja bakteryjna: metoda szoku termicznego

Transformacja jest procesem, który zachodzi, gdy komórka pobiera obcy DNA z otoczenia. Transformacja może występować w naturze u niektórych rodzajów...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Podstawy biologii

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology

Przemiana bakteryjna: metoda szoku cieplnego

using a hemacytometer to count cells

Używanie hemekytometru do liczenia komórek

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant ...

passaging cells

Komórki pasażujące

Cell lines are frequently used in biomedical experiments, as they allow rapid culture and expansion of cell types for experimental analysis. Cell lines ...

pcr: the polymerase chain reaction

PCR: reakcja łańcuchowa polimerazy

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

dna gel electrophoresis

Elektroforeza żelu DNA

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

separating protein with sds-page

Oddzielanie białka za pomocą SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

bacterial transformation: the heat shock method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

bacterial transformation: electroporation

Przemiana bakteryjna: elektroporacja

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

the elisa method

Metoda ELISA

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is typically performed to detect the presence and/or amount of a target protein of interest within an ...

plasmid purification

Oczyszczanie plazmidu

Plasmid purification is a technique used to isolate and purify plasmid DNA from genomic DNA, proteins, ribosomes, and the bacterial cell wall. A plasmid ...

gel purification

Oczyszczanie żelu

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

the western blot

Zachodnia plama

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

an introduction to transfection

Wprowadzenie do transfekcji

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

dna ligation reactions

Reakcje ligacji DNA

In molecular biology, ligation refers to the joining of two DNA fragments through the formation of a phosphodiester bond.  An enzyme known as a ligase ...

restriction enzyme digests

Trawienie enzymów restrykcyjnych

Restriction enzymes or endonucleases recognize and cut DNA at a specific sequence.  These enzymes occur naturally in bacteria as a defense against ...

molecular cloning

Klonowanie molekularne

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

This collection demonstrates how to execute basic techniques commonly used in cellular and molecular biology.

Rozwiąż ten quiz, aby sprawdzić swoją wiedzę na temat transformacji bakteryjnej i metody szoku termicznego. Pytania ćwiczeniowe obejmują kompetentne komórki E. coli, plazmidy, wielostronnicze miejsce klonowania, miejsce rozpoczęcia replikacji, geny oporności na antybiotyki, chlorek wapnia, szok termiczny w temperaturze 42°C oraz selekcję kolonii.

Jaki jest główny cel transformacji bakteryjnej?

Komórki, które łatwo pobierają DNA, nazywane są komórkami kompetentnymi.

Plazmid to mała, kolista, dwuniciowa {{slot:blank_1}}.

Jaka jest rola miejsca wielokrotnego klonowania w plazmidzie?

Miejsce inicjacji replikacji wskazuje komórce, gdzie powinna rozpocząć się replikacja plazmidu.

Która cecha plazmidu pozwala transformowanym komórkom przetrwać na pożywkach zawierających antybiotyki? {{slot:dropdown_1}}

Dlaczego komórki są poddawane działaniu środowiska bogatego w wapń przed transformacją?

Podczas szoku termicznego tworzą się pory, które umożliwiają wprowadzenie superzwiniętego kolistego DNA plazmidowego do wnętrza komórki.

Jaki jest główny cel stosowania techniki aseptycznej w pracy z bakteriami?

Która sekwencja kroków najlepiej odpowiada procedurze szoku termicznego po rozmrożeniu komórek kompetentnych?

Ćwiczenie: Przemiana bakteryjna: metoda szoku cieplnego Quiz

Ten quiz sprawdzający obejmuje kluczowe zagadnienia dotyczące transformacji bakteryjnej metodą szoku termicznego, w tym wnikanie superzwiniętego plazmidu przez pory błonowe, typowe ilości używanych plazmidów, rolę transformacji w amplifikacji obcego DNA, moment dodawania antybiotyków do selektywnych płytek agarowych oraz interpretację wyników selekcji błękitno-białej w celu stwierdzenia pobrania plazmidu rekombinowanego.

Video Quiz

Niniejszy quiz oceniający obejmuje podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej, w tym liczenie komórek i ocenę ich żywotności za pomocą komory licznikowej (hemacytometru), pasażowanie komórek i warunki hodowli, projektowanie i cykle PCR, elektroforezę żelową i oczyszczanie DNA, SDS-PAGE i immunoblotting, transformację bakteryjną metodą szoku termicznego i elektroporacji, detekcję białek metodą ELISA oraz oczyszczanie plazmidów.

Chapter Quiz

Podstawy biologii - Rozdział 2: Podstawowe metody biologii komórkowej i molekularnej

Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education