Name: Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education
Uploaded: 2023-04-30T06:22:28.000Z
Description: Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<div id="script_0">
Бактериальная трансформация — это широко используемый метод введения чужеродной ДНК в бактериальную клетку, которая затем может амплифицировать или клонировать эту ДНК. Клетки, способные легко поглощать такую ДНК, называют компетентными клетками. Хотя трансформация естественным образом происходит у многих типов бактерий, ученые нашли способы искусственно индуцировать и повышать компетентность бактериальных клеток. В этом видео мы обсудим один из таких способов — трансформацию методом теплового шока.
</div>
<div id="script_1">
Прежде чем перейти к технике теплового шока, давайте обсудим тип ДНК, который чаще всего используется при бактериальной трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную ДНК, которая может уменьшать свой размер за счет суперскручивания, что позволяет ей легко проходить через поры в клеточной мембране.
Плазмида содержит несколько важных областей, о которых стоит упомянуть. Коммерчески доступные плазмиды содержат полилинкер или MCS (multiple cloning site). Эта область содержит специфические последовательности, распознаваемые рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами, которые расщепляют ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес для исследователя, могут быть вставлены в полилинкер, если плазмида и фрагмент ДНК разрезаны одними и теми же эндонуклеазами.
Плазмиды также содержат точку начала репликации, или ORI (Origin of Replication), которая дает клетке информацию о том, где должна начаться репликация плазмиды.
Помимо точки начала репликации и полилинкера, большинство плазмид содержат ген устойчивости к антибиотикам. Этот ген обеспечивает устойчивость к антибиотикам всех клеток, содержащих плазмиду, что позволяет этим клеткам выживать в средах, содержащих антибиотик.
Теперь, когда мы обсудили плазмиды, давайте поговорим о клетках, в которые они будут введены: компетентных клетках. Наиболее часто используемым типом бактерий в исследованиях по молекулярной биологии и трансформации является E. coli, которая также обитает в вашем нижнем отделе кишечника. Клетки обычно делают компетентными путем воздействия среды, богатой кальцием.
Положительные заряды ионов кальция нейтрализуют отрицательные заряды как плазмиды, так и клеточной стенки бактерий, устраняя электростатическое отталкивание и ослабляя клеточную стенку.
При воздействии на клетки резкого повышения температуры, или теплового шока, создается разница давлений между внешней и внутренней сторонами клетки, что индуцирует образование пор, через которые может проникнуть суперскрученная плазмидная ДНК. После возвращения клеток к нормальной температуре клеточная стенка восстанавливается самостоятельно.
После того как клетки поглотили плазмиду, они смогут расти на агарных плашках с добавлением антибиотика.
</div>
<div id="script_2">
Перед началом трансформации методом теплового шока очистите рабочую область и убедитесь, что все оборудование стерильно.
Убедитесь, что подготовлено достаточное количество сред и агара, обеспечивающих питание бактерий, которые вы будете делать компетентными. Также обязательно стерилизуйте все растворы путем автоклавирования. Дайте жидким средам остыть до комнатной температуры перед использованием, а агару — до 50-55˚C; при этой температуре можно добавлять антибиотик и разливать среду по чашкам. Дайте чашкам остыть до комнатной температуры для затвердевания.
При работе с бактериями всегда следует использовать асептическую технику для поддержания стерильности. Асептическая техника обычно предполагает использование горелки Бунзена для стерилизации инструментов и реагентов, а также для создания конвекционного потока, который предотвращает попадание загрязнителей из воздуха в рабочую зону.
Непосредственно перед реакцией теплового шока доведите среды до комнатной температуры, а чашки с LB-агаром, содержащим антибиотик, — до 37°C. Также убедитесь, что температура водяной бани составляет 42°C.
Затем разморозьте химически компетентные клетки на льду.
Добавьте 1-5uL холодной плазмиды в концентрации 1ng/μL к бактериальным клеткам, осторожно перемешайте и верните смесь клеток и плазмиды на лед на 30 минут.
По истечении этого времени подвергните смесь клеток и плазмиды тепловому шоку, поместив ее в водяную баню при 42˚C на 30 секунд.
Сразу после извлечения пробирки из водяной бани поместите ее на лед и добавьте 450μL среды. Поместите пробирку в шейкер-инкубатор при 37°C на 1 час при скорости более 225 rpm для восстановления клеток.
Соблюдая правила асептической техники, нанесите 20-200uL бактериальной суспензии на чашку с LB-агаром и распределите среду по поверхности с помощью бактериологического шпателя. Инкубируйте чашки в перевернутом виде в течение ночи при 37˚C, чтобы предотвратить воздействие конденсата на бактерии.
На следующий день бактерии, поглотившие плазмиду, образуют колонии.
Далее подсчитайте количество колоний для расчета эффективности трансформации, которая представляет собой количество успешно трансформированных клеток, деленное на общее количество высеянной ДНК.
Теперь можно отобрать колонии для дальнейших экспериментов.
</div>
<div id="script_3">
До приведения в компетенцию бактерии, используемые при трансформации, хранятся в морозильной камере. Их необходимо разморозить на льду, высеять на агаризированный планшет без антибиотиков и оставить для инкубации в течение ночи при 37˚C.
Соблюдая правила асептики, выберите отдельную бактериальную колонию с агарозного планшета и культивируйте её в большом объеме среды (500 ml) в течение ночи при 37˚C в in-кубаторе с перемешиванием — приборе, который предотвращает седиментацию бактерий и обеспечивает равномерное распределение питательных веществ в среде.
Пока клетки растут, приготовьте 0.1 molar раствор хлорида кальция и 0.1 molar раствор хлорида кальция с 15% глицерином; простерилизуйте их в автоклаве и охладите.
Измерения абсорбции используются для определения того, находятся ли бактерии в середине логарифмической фазы роста, при которой они легче всего поглощают ДНК. Как только клетки достигнут этой фазы, поместите их на лед и держите там на протяжении всей процедуры.
Затем разделите бактериальные клетки в две большие центрифужные пробирки и центрифугируйте при 4°C. Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок примерно в 100 ml холодного 0.1 molar хлорида кальция. После этого инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут. Этот этап повторяют как минимум еще один раз. Циклы центрифугирования и ресуспендирования клеток часто называют промывкой клеток.
После последней промывки ресуспендируйте клетки в 50mL холодного 0.1 molar раствора хлорида кальция с 15% глицерином. Теперь эти клетки стали химически компетентными.
Распределите по 50μL бактерий в несколько микроцентрифужных пробирок и храните при -80˚C до начала процедуры теплового шока.
</div>
<div id="script_4">
Существует множество применений и вариаций бактериальной трансформации.
Помимо теплового шока, электропорация является еще одним распространенным методом трансформации. Как следует из названия, электропорация подразумевает использование электрического тока для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые может проникнуть ДНК.
Что касается скрининга трансформированных бактерий, плазмиды часто содержат ген, кодирующий фермент бета-галактозидазу, для облегчения этого процесса. Если в агаризованные среды добавить субстрат для этого фермента, то бактерии, трансформированные плазмидами с вставкой, образуют белые колонии, в то время как бактерии без вставки образуют синие колонии. Этот метод называется сине-белым скринингом.
В большинстве экспериментов по трансформации целью является получение быстро делящихся бактерий для наработки больших количеств вашей плазмиды, содержащей целевой ген. После бактериальной трансформации следующим этапом является выращивание большого количества бактерий в жидкой среде, содержащей антибиотики, и проведение очистки плазмид, которая, как следует из названия, заключается в выделении плазмид из бактерий. Для этой цели доступно множество коммерческих наборов.
Иногда целью трансформации является получение бактериями больших количеств белка, кодируемого плазмидой. Здесь показаны бактериальные клетки, которые подвергаются гомогенизации и лизису перед проведением метода, называемого аффинной очисткой, для выделения целевого белка. После очистки большого количества белка его можно кристаллизовать, чтобы определить структуру интересующего белка.
</div>
<div id="script_5">
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по трансформации методом теплового шока. В этом видео мы рассмотрели: что такое трансформация методом теплового шока и как она работает, лежащий в её основе принцип, а также способы успешной трансформации бактерий. Спасибо за просмотр!
</div>

Бактериальная трансформация: метод теплового шока

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Трансформация — это процесс, при котором клетка поглощает чужеродную ДНК из окружающей среды. В природе трансформация может происходить у определенных типов бактерий. В молекулярной биологии трансформация воспроизводится искусственно в лабораторных условиях путем создания пор в мембранах бактериальных клеток. Бактериальные клетки, способные поглощать ДНК из окружающей среды, называются компетентными клетками. В лабораторных условиях бактериальные клетки можно сделать компетентными с последующим введением ДНК с помощью процедуры, называемой методом теплового шока.
Трансформация методом теплового шока использует среду, богатую ионами кальция (обеспечиваемую хлоридом кальция), чтобы нейтрализовать электростатическое отталкивание между плазмидной ДНК и клеточной мембраной бактерий. Резкое повышение температуры создает поры в плазматической мембране бактерий, что позволяет плазмидной ДНК проникнуть внутрь бактериальной клетки. В данном видео представлен пошаговый протокол подготовки химически компетентных бактерий, проведения трансформации методом теплового шока, посева трансформированных бактерий на чашки и расчета эффективности трансформации.

Трансформация — это процесс, при котором клетка поглощает чужеродную ДНК из окружающей среды. В природе трансформация может происходить у определенных типов...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Education

JoVE Science Education

JoVE: Научное образование

Basic Biology

Основы биологии

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Основные методы клеточной и молекулярной биологии

basic-methods-in-cellular-and-molecular-biology

using a hemacytometer to count cells

Использование гемацитометра для подсчета клеток

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant ...

passaging cells

Пропускание клеток

Cell lines are frequently used in biomedical experiments, as they allow rapid culture and expansion of cell types for experimental analysis. Cell lines ...

pcr: the polymerase chain reaction

ПЦР: полимеразная цепная реакция

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

dna gel electrophoresis

Электрофорез в ДНК-геле

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

separating protein with sds-page

Разделение белка с помощью SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

bacterial transformation: the heat shock method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

bacterial transformation: electroporation

Бактериальная трансформация: электропорация

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

the elisa method

Метод ИФА

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is typically performed to detect the presence and/or amount of a target protein of interest within an ...

plasmid purification

Очистка плазмид

Plasmid purification is a technique used to isolate and purify plasmid DNA from genomic DNA, proteins, ribosomes, and the bacterial cell wall. A plasmid ...

gel purification

Очищение гелем

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

the western blot

Западное пятно

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

an introduction to transfection

Введение в трансфекцию

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

dna ligation reactions

Реакции лигирования ДНК

In molecular biology, ligation refers to the joining of two DNA fragments through the formation of a phosphodiester bond.  An enzyme known as a ligase ...

restriction enzyme digests

Ферменты рестрикции Digests

Restriction enzymes or endonucleases recognize and cut DNA at a specific sequence.  These enzymes occur naturally in bacteria as a defense against ...

molecular cloning

Молекулярное клонирование

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

This collection demonstrates how to execute basic techniques commonly used in cellular and molecular biology.

Пройдите этот тест, чтобы проверить свои знания о бактериальной трансформации и методе теплового шока. Практические вопросы охватывают темы компетентных клеток E. coli, плазмид, полилинкера (множественного сайта клонирования), точки начала репликации, генов устойчивости к антибиотикам, хлорида кальция, теплового шока при 42°C и селекции колоний.

Какова основная цель бактериальной трансформации?

Клетки, которые легко поглощают ДНК, называются компетентными клетками.

Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную {{slot:blank_1}}.

Какова роль полилинкера (множественного сайта клонирования) в плазмиде?

Точка начала репликации указывает клетке, где должна начаться репликация плазмиды.

Какая характеристика плазмиды позволяет трансформированным клеткам выживать в средах, содержащих антибиотики? {{slot:dropdown_1}}

Зачем клетки подвергают воздействию среды, богатой кальцием, перед трансформацией?

При тепловом шоке образуются поры, которые позволяют суперскрученной плазмидной ДНК проникать в клетку.

Какова основная цель применения асептических методов при работе с бактериями?

Какая последовательность действий наилучшим образом соответствует процедуре теплового шока после размораживания компетентных клеток?

Практика: Бактериальная трансформация: метод теплового шока Quiz

Этот проверочный тест охватывает ключевые концепции бактериальной трансформации методом теплового шока, включая проникновение суперскрученных плазмид через мембранные поры, типичные количества используемых плазмид, роль трансформации в амплификации чужеродной ДНК, время добавления антибиотиков в селективный агар, а также интерпретацию результатов сине-белого скрининга для определения поглощения рекомбинантных плазмид.

Video Quiz

Этот проверочный тест охватывает основные методы клеточной и молекулярной биологии, включая подсчет количества и жизнеспособности клеток с помощью гемоцитометра, пассирование клеток и условия культивирования, дизайн ПЦР и циклы амплификации, электрофорез и очистку ДНК в геле, SDS-PAGE и иммуноблоттинг, бактериальную трансформацию методом теплового шока и электропорацию, определение белков с помощью метода ELISA и очистку плазмид.

Chapter Quiz

Основы биологии — Гл. 2: Основные методы клеточной и молекулярной биологии

Watch how Bacterial Transformation: The Heat Shock Method works through a 11-min animated science video. Part of the Basic Biology - Basic Methods in Cellular and Molecular Biology collection on JoVE Science Education.

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method | Basic Biology | Concepts, Methods & Applications | JoVE Science Education