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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Trasformazione batterica: il metodo dello shock termico

Overview

La trasformazione è il processo che si verifica quando una cellula ingerisce DNA estraneo dall'ambiente circostante. La trasformazione può avvenire in natura in alcuni tipi di batteri. In biologia molecolare, la trasformazione viene riprodotta artificialmente in laboratorio attraverso la creazione di pori nelle membrane cellulari batteriche. Le cellule batteriche che sono in grado di prendere il DNA dall'ambiente sono chiamate cellule competenti. In laboratorio, le cellule batteriche possono essere rese competenti e il DNA successivamente introdotto con una procedura chiamata metodo dello shock termico.

La trasformazione dello shock termico utilizza un ambiente ricco di calcio fornito dal cloruro di calcio per contrastare la repulsione elettrostatica tra il DNA plasmidico e la membrana cellulare batterica. Un improvviso aumento della temperatura crea pori nella membrana plasmatica dei batteri e consente al DNA plasmidico di entrare nella cellula batterica. Questo video passa attraverso una procedura passo-passo su come creare batteri chimicamente competenti, eseguire la trasformazione dello shock termico, placcare i batteri trasformati e calcolare l'efficienza della trasformazione.

Procedure

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La trasformazione batterica è un metodo ampiamente utilizzato in cui il DNA estraneo viene introdotto in un batterio, che può quindi amplificare o clonare il DNA. Le cellule che hanno la capacità di assumere prontamente questo DNA sono chiamate cellule competenti. Sebbene la trasformazione avvenga naturalmente in molti tipi di batteri, gli scienziati hanno trovato il modo di indurre e migliorare artificialmente la competenza di una cellula batterica. In questo video parleremo di uno di questi modi, la trasformazione dello shock termico.

Prima di parlare della tecnica dello shock termico, discutiamo prima del tipo di DNA più comunemente usato nella trasformazione batterica: il plasmide. Un plasmide è un DNA piccolo, circolare, a doppio filamento che può ridurre le sue dimensioni mediante supercoiling, in modo che possa facilmente passare attraverso i pori in una membrana cellulare.

Un plasmide contiene alcune regioni importanti degne di nota. I plasmidi disponibili in commercio contengono un sito di clonazione multipla o MCS. Questa regione contiene sequenze specifiche riconosciute da endonucleasi di restrizione o enzimi di restrizione, che scissono il DNA. Frammenti di DNA di interesse per il ricercatore possono essere inseriti nel sito di clonazione multipla quando il plasmide e il frammento di DNA vengono tagliati con le stesse endonucleasi.

I plasmidi contengono anche un'origine di replicazione, o ORI, che fornisce informazioni alla cellula su dove dovrebbe iniziare la replicazione del plasmide.

Oltre all'origine della replicazione e al sito di clonazione multipla, la maggior parte dei plasmidi includerà un gene di resistenza agli antibiotici. Questo gene conferisce resistenza agli antibiotici a tutte le cellule che contengono il plasmide, consentendo a quelle cellule di sopravvivere in mezzi contenenti antibiotici.

Ora che abbiamo discusso dei plasmidi, parliamo delle cellule in cui verranno introdotti: le cellule competenti. Il tipo più comunemente usato di batteri nella ricerca e trasformazione in biologia molecolare è E. coli, che abita anche l'intestino inferiore. Le cellule sono in genere rese competenti attraverso l'esposizione a un ambiente ricco di calcio.

Le cariche positive degli ioni calcio neutralizzano le cariche negative sia del plasmide che della parete cellulare batterica dissipando la repulsione elettrostatica e indebolendo la parete cellulare.

Esponendo le cellule ad un improvviso aumento di temperatura, o shock termico, si crea una differenza di pressione tra l'esterno e l'interno della cellula, che induce la formazione di pori, attraverso i quali può entrare il DNA plasmidicoled supercoiled. Dopo aver riportato le cellule a una temperatura più normale, la parete cellulare si auto-guarirà.

Una volta che le cellule hanno assorbito il plasmide, saranno in grado di crescere su piastre di agar allacciate con antibiotici.

Prima di iniziare la trasformazione dello shock termico, pulire l'area di lavoro e assicurarsi che tutte le apparecchiature siano sterilizzate.

Assicurati di avere abbastanza media e agar preparati, che forniscono la nutrizione ai batteri che renderai competenti. Assicurati anche di sterilizzare tutte le soluzioni tramite autoclave. Lasciare raffreddare i liquidi a temperatura ambiente prima dell'uso e lasciare raffreddare l'agar a 50-55 ° C, la temperatura alla quale è possibile aggiungere antibiotico e versare le piastre. Lasciare raffreddare le piastre a temperatura ambiente per solidificare.

Quando si lavora con i batteri, si dovrebbe sempre usare la tecnica asettica per mantenere la sterilità. La tecnica asettica prevede in genere l'uso di un bruciatore Bunsen per sterilizzare strumenti e reagenti e creare una corrente di convezione, che mantiene i contaminanti presenti nell'aria fuori dallo spazio di lavoro.

Immediatamente prima della reazione di shock termico, preriscaldare il supporto a temperatura ambiente e le piastre di agar LB contenenti antibiotici a 37 ° C. Assicurati anche che il tuo bagno d'acqua sia a 42 ° C.

Quindi, scongelare le cellule chimicamente competenti sul ghiaccio.

Aggiungere 1-5uL di plasmide freddo 1ng / μL alle cellule batteriche, mescolare delicatamente e riportare la miscela di cellule e plasmidi al ghiaccio per 30 minuti.

Quando il tempo è smodato, shock termico della miscela di cellule e plasmidi mettendola a bagnomaria a 42 ° C per 30 secondi.

Subito dopo aver eseguito il tubo dal bagno d'acqua, metterlo sul ghiaccio e aggiungere 450μL di media. Metterlo in un incubatore vibrante per 37°C per 1 ora a oltre 225 giri/min in modo che le celle possano recuperare.

Usando una corretta tecnica asettica, aggiungere 20-200uL batteri a una piastra di agar LB e distribuire il mezzo con uno spargitore batterico. Incubare le piastre durante la notte a 37° C capovolte per prevenire l'esposizione dei batteri alla condensa.

Il giorno dopo, i batteri che hanno preso nel plasmide formano colonie.

Quindi, conta le colonie per calcolare l'efficienza di trasformazione, che è il numero di trasformanti di successo diviso per la quantità totale di DNA placcato.

Ora, le colonie possono essere selezionate per ulteriori sperimentazioni.

Prima di essere resi competenti i batteri utilizzati nella trasformazione vengono conservati nel congelatore. Devono essere scongelati sul ghiaccio, spalmati su una piastra di agar – senza antibiotici e lasciati crescere durante la notte a 37 ° C.

Usando la tecnica asettica, selezionare una colonia batterica dalla piastra di agar e coltivarla in una grande coltura da 500 ml durante la notte a 37 ° C in un incubatore vibrante - uno strumento che impedisce la sedimentazione dei batteri e persino la dispersione di sostanze nutritive nel mezzo.

Mentre le cellule crescono producono 0,1 molari di cloruro di calcio e 0,1 molare di cloruro di calcio più soluzioni di glicerolo al 15%, autoclave e lasciare raffreddare.

Le misurazioni dell'assorbanza vengono utilizzate per determinare se i batteri sono o meno nella loro fase di crescita a metà registro, il che significa che assorbiranno prontamente il DNA. Una volta che le cellule hanno raggiunto questa fase, metterle sul ghiaccio e tenerle lì durante la procedura.

Quindi, separare le cellule batteriche in due grandi tubi centrifughi e ruotare a 4 ° C. Versare il surnatante e risusediare in circa 100 ml 0,1 molari di cloruro di calcio freddo. Quindi, incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti. Questo passaggio viene ripetuto almeno una volta di nuovo. I cicli di rotazione e riconsuscimento delle cellule sono spesso indicati come lavaggio delle cellule.

Dopo il lavaggio finale, risusemere le cellule in un freddo 50mL 0,1 molare cloruro di calcio più soluzione di glicerolo al 15%. Queste cellule sono ora chimicamente competenti.

Distribuire 50μL di batteri in più tubi di microfuga e conservare a -80 ° C fino a quando non sono pronti per lo shock termico.

Esistono molte applicazioni e variazioni della trasformazione batterica.

Oltre allo shock termico, l'eletroporazione è un'altra tecnica comune per la trasformazione. Come suggerisce il nome, l'elettroporazione comporta l'uso di elettricità per creare pori nella membrana cellulare batterica attraverso la quale il DNA può passare.

Per quanto riguarda lo screening per i batteri trasformati, i plasmidi spesso contengono un gene che codifica per l'enzima beta-galattosidasi per aiutare con lo screening. Quando il substrato di questo enzima è incluso in piastre di agar, i batteri che sono stati trasformati con plasmidi contenenti un inserto producono colonie bianche, mentre quelli che non lo fanno, producono colonie blu. Questo metodo è indicato come screening blu e bianco.

Nella maggior parte degli esperimenti di trasformazione l'obiettivo è quello di ottenere batteri in rapida divisione per produrre grandi quantità del plasmide, che include il gene bersaglio. Dopo la trasformazione batterica, il passo successivo è quello di far crescere grandi quantità di batteri in un mezzo liquido contenente antibiotici ed eseguire la purificazione dei plasmidi, che, come suggerisce il nome, comporta la purificazione dei plasmidi dai batteri. Molti kit commerciali sono disponibili per questo scopo.

A volte l'obiettivo della trasformazione è quello di far generare ai batteri grandi quantità di proteine codificate dal plasmide. Qui si vedono le cellule batteriche omogeneizzate e lizzate prima che una tecnica chiamata purificazione dell'affinità possa essere eseguita per isolare la proteina bersaglio. Dopo aver purificato grandi quantità della proteina può quindi essere cristallizzata e la struttura della particolare proteina di interesse può essere identificata.

Hai appena visto JoVE Introduzione alle trasformazioni degli shock termici. In questo video abbiamo esaminato: cos'è la trasformazione dello shock termico e come funziona, il principio dietro di esso e come trasformare con successo i batteri. Grazie per l'attenzione!

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